分子实验进阶
酵母Cre-loxP敲除与标记回收：HO教学位点的两阶段验证
以已验证敲除片段开始，分开检查基因替换、G418标记移除与Cre质粒清除。
约2–3周
从第一次配液，到独立完成实验
实验怎么做？
从这一步开始。
用量配清楚，时间写明白，操作拆成每一步。
细胞、分子、动物实验，还有图解与实用文档。
YOUR FIRST EXPERIMENT先知道加多少，
先知道加多少，
再知道下一步做什么。
01核对体系02照表配液03逐步操作04检查结果
每篇都从适用条件开始，配套用量、时间和记录。
分子实验
73 篇指南分子实验进阶
DpnI定点突变：4 kb无害教学质粒的全质粒扩增与测序
以dam⁺模板、明确Pfu体系和DpnI消化建立点突变，设置无引物背景对照。
约4–5天
分子实验进阶
非放射性Southern杂交：DIG探针检测3 kb教学DNA片段
用毛细转膜、DIG免疫检测和阳阴性教学片段练习完整Southern路线。
约3天
分子实验进阶
酚胍法总RNA提取：一皿培养细胞的分相、沉淀与洗涤
固定1 mL TRIzol规模，以水相转移和实测RNA质量控制分相污染。
约90分钟
分子实验进阶
oligo(dT)纯化mRNA：生物素寡聚dT与链霉亲和素磁分离
以200 μg总RNA完成poly(A)富集，明确与旧纤维素柱路线的替换关系。
约1小时
分子实验进阶
非放射性RNase保护实验：生物素反义探针与245 nt保护片段
从10 μg总RNA杂交、RNase消化到变性胶和链霉亲和素化学发光检测。
约2天
分子实验进阶
DIG-LNA小RNA Northern：尿素胶、EDC固定与化学发光
使用5 μg总RNA检测约22 nt小RNA，明确区分旧甲醛长RNA路线。
约2天
分子实验进阶
LexA酵母双杂交定向验证：自激活排查与双报告判读
从已验证转化株开始，以四种配对、诱导对照和独立克隆确认候选互作。
约1周
分子实验入门
非致病大肠杆菌重组蛋白表达：10 mL诱导对照试验
使用已测序确认、携带pET-kan型非病毒His-GFP教学质粒的非致病BL21(DE3)，每个诱导和未诱导培养各10 mL。
2天
分子实验进阶
His标签Ni-NTA纯化：0.5 mL树脂的原生条件分级回收
从非致病BL21(DE3)表达的无害His-GFP澄清裂解液5 mL开始，目标蛋白估计不超过0.5 mg，使用0.5 mL沉降体积Ni-NTA琼脂糖及重力柱。
约3小时
分子实验进阶
包涵体溶解与小规模稀释复性：His-GFP条件筛查
用指导者已从无害His-GFP表达菌制得并洗过的包涵体沉淀10 mg湿重开展小试。
约2天
分子实验入门
硫酸铵分级沉淀：10 mL教学蛋白液的0–30%与30–60%分段
以指导者提供的10 mL非感染性教学蛋白混合液为样本，基液50 mM Tris-HCl pH7.5，无硫酸铵，蛋白总浓度约1–5 mg/mL。
约3小时另加透析