His标签Ni-NTA纯化：0.5 mL树脂的原生条件分级回收

02实验原理

组氨酸标签配位结合固定镍，低浓度咪唑降低非特异吸附，高浓度咪唑竞争洗脱。输入、流穿、洗涤及每个洗脱均保留，依SDS-PAGE和GFP荧光而非颜色决定合并。

04材料与仪器

5 mL澄清His-GFP裂解液、Ni-NTA50%浆液1 mL、重力柱、冷室/冰盒、收集管；1 M Tris-HCl pH8.0、5 M NaCl、1 M咪唑pH8.0储液、超纯水；蛋白定量与SDS-PAGE设备。

05配液与用量

柱体积CV=0.5 mL；平衡10 CV=5 mL、洗涤20 CV=10 mL、洗脱6 CV=3 mL，分6×0.5 mL。裂解液应在结合液中，必要时先透析；不能只靠小体积高浓盐使不明基质“变合适”。

06时间安排

07开始前的准备

测输入浓度并预留50 μL；确认裂解液无可见颗粒，需再澄清时10000×g、4°C20分钟并记录损失。清楚树脂浆液浓度，50%浆液1 mL不是1 mL CV。本配方为低负载教学设置，首次用目标蛋白时保留所有流分验证。

08逐步操作

1. 配三种缓冲液，分别补足到50 mL，测量并记录pH及测量温度；冷却至4°C。
2. 标记输入I、流穿FT、洗涤W1/W2及洗脱E1–E6管，记录5 mL样本的浓度和目标质量估计。
3. 轻轻混匀50%Ni-NTA浆液，取1 mL浆液装柱，重力沉降得到0.5 mL树脂床。
4. 放尽保存液至液面刚接近树脂床，立刻分次加入总5 mL结合液平衡，始终保持床面湿润。
5. 取50 μL输入保留后，把其余裂解液缓慢加柱，调节流速约0.2–0.5 mL/分钟，完整收集FT并量体积。
6. 将FT再过柱一次作为本例充分结合步骤，收集最终FT；如流穿仍大量绿色，保留等待检测。
7. 分两次各加5 mL洗涤液，分别收W1/W2，不能倒掉全部后才怀疑目标流失。
8. 让残余洗液下降至床面上方，加入0.5 mL洗脱液，收集E1；不要把空气吸进树脂。

   

9. 依次再加5份0.5 mL洗脱液，收集E2–E6，所有管冰上放置，记录实际回收体积。
10. 各流分取等体积做快速荧光检查；按已验证兼容方法测总蛋白，咪唑基质用对应空白。
11. 把I、FT、W1/W2及E1–E6上SDS-PAGE，记录各自稀释倍数；用身份检测确认目标条带。
12. 只合并目标丰富且污染较少的连续洗脱管，记录合并体积，必要时透析去咪唑后再做活性检测。
13. 核算回收质量与分布；树脂按本地已验证再生流程处理或作为含镍固废，不在本文临时配再生酸。

09结果判断与质控

主要目标应在洗脱组分，FT与W中显著目标提示结合或洗涤不合适。用质量回收和胶图评价，不宣称一次柱必达某纯度。GFP荧光提示构象但不代替身份鉴定；本方案不适用于变性8 M尿素样本。

10实验记录模板

11常见问题与排错

不结合：查pH、标签、EDTA及输入负载。杂带多：先核对洗涤及输入质量，小试优化而不一次大幅提高咪唑。蛋白沉淀：保留沉淀和上清，检查冷却、盐及浓度，不能只测澄清液便称高回收。

12参考资料

旧来源：网络手册物理168页、短版12–13页（原文为变性Ni-NTA路线，缺少完整缓冲液，故不直接移植）。现代核对：EMBL PEPCF，Affinity chromatography及Choice of lysis buffer，查阅2026-11-02；核对澄清上样、结合/洗涤/竞争洗脱、His标签250 mM–1 M咪唑洗脱及避免EDTA。本文明确采用原生低负载250 mM咪唑教学路线，缓冲体积与CV独立复算。