01本篇适用条件
适用于非感染性纯化 DNA 或常规 PCR 产物的分析，不用于 RNA、超短片段或回收用于克隆的 DNA。采用约 7×10 cm 小胶、至少 15 μL 孔容量，1×TAE 制胶和跑胶，电泳后在指定区域用 EtBr 染色。EtBr 为有害核酸染料，须由接受化学品培训者操作，使用专用废液容器；不能将下述 EtBr 体积用于其他浓度染料。
02实验原理
DNA 在电场中总体向正极迁移，在琼脂糖凝胶中因片段大小和构象差异得到分离。凝胶浓度按目标片段大小和试剂体系选择；超螺旋质粒与线性 DNA 的迁移不能简单按同一大小对应。
03安全与适用范围
佩戴实验服、手套和护目镜。核酸染料、裂解液及电泳设备按试剂 SDS 与机构 SOP 使用；接触样本后更换手套。人源及动物来源样本还需符合相应生物安全与伦理要求。
04材料与仪器
- 琼脂糖、标准 50×TAE、水、6×DNA loading dye、ready-to-use 1 kb ladder、DNA 样本。
- 250 mL 耐热三角瓶、0.50 g 可准确称量的天平、微波炉、耐热手套、制胶架、梳子、小胶电泳槽及带盖电源。
- EtBr 10 mg/mL 原液、专用有盖染色盒、摇床及指定染料废液桶；防漏托盘及手套。
- 带完整联锁罩的 UV 凝胶成像仪、专用废胶容器。禁止在打开 UV 防护罩时看胶。
05配液与用量
| 用途 | 配制量 | 配方与最终浓度 |
|---|---|---|
| 1×TAE 工作液 | 1 L | 已标定 50×TAE 20 mL + 水 980 mL；得到 40 mM Tris、20 mM 乙酸、1 mM EDTA 的标准 1×体系 |
| 1% 琼脂糖胶 | 50 mL | 琼脂糖 0.50 g + 1×TAE 50 mL；不在胶里预加染料 |
| 一份待上样液 | 12 μL | PCR 产物 5 μL + 水 5 μL + 6×loading dye 2 μL；终浓度 1×，本次上样 10 μL |
| 低浓度 EtBr 后染液 | 100 mL | 1×TAE 100 mL 加 10 mg/mL EtBr 5 μL，近似终浓度 0.5 μg/mL；仅后染使用 |
| DNA ladder | 一泳道 | 选已含 1×上样液、说明书推荐一次上样量 5 μL 的 ready-to-use 1 kb ladder，直接上 5 μL |
50×TAE 原液的组成必须与上表定义一致。购买其他定义的浓缩液时按瓶签稀释，不能默认所有“TAE”原液都是 50×。本教学所列体积含有 20% 左右上样余量，不把余量全部塞进孔。
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 约用时 |
|---|---|---|
| 配液及溶胶 | 微波短脉冲加热，溶清后冷至约 50°C | 15–20 分钟 |
| 凝胶成形 | 室温 20–25°C | 20–30 分钟 |
| 跑胶 | 约 5 V/cm，染料到胶长 75% 时停 | 40–70 分钟 |
| 后染及成像 | 室温轻摇后染 20–30 分钟、水洗 5 分钟 | 30–40 分钟 |
07开始前的准备
先画泳道图：1 为 ladder，2 为已知阳性产物，3 为待测样本，4 为对应 PCR 的 NTC。核对各孔容量至少 15 μL。确认电泳槽适合约 50 mL 胶，其最大电压、电流和液体容量均覆盖本次设置；测量两电极之间距离，不用胶长度代替电极距离。本例距离 20 cm 时设 100 V，距离 15 cm 时设 75 V，使电场约 5 V/cm；设备额定上限更低时采用更低值。先准备好 EtBr 专用操作区及废物路线，仪器电缆破损、盖子缺失或联锁失效则停止。
08逐步操作
- 将 20 mL 标准 50×TAE 加入量筒，加水至总体积 1000 mL，盖紧颠倒混匀。写明“1×TAE、日期”，后续胶和槽均从这一瓶取液。
- 在耐热瓶中放 0.50 g 琼脂糖，加入 50 mL 1×TAE，轻摇使粉末分散。瓶口保持能泄压，不拧紧密封盖，不用普通离心管微波。
- 微波先加热约 30 秒，戴耐热手套取出轻摇，再按 10–20 秒脉冲加热并观察，直到无可见颗粒、液体澄清。总时长随功率变化，不能为凑固定分钟数继续煮沸；喷溅或大量蒸发时停下重配。
- 在隔热垫上冷却至约 50°C，用温度计核对；不要用裸手抓热瓶判断。安装制胶挡板和梳子，确认不漏，再缓慢倒胶；用干净枪头把气泡赶离梳齿周围。
- 室温静置 20–30 分钟，直到整块凝胶均匀不透明且不流动。向上平稳拔梳，不左右撕扯孔壁；若孔底破裂，改用完好孔或重新制胶。
- 将胶连托盘放入槽，加样孔靠近黑色负极。加入 1×TAE 至胶面上方约 2–3 mm，并低于设备最大线；本例先准备约 400 mL，实际加入量以槽形与液面为准，记录实际用量。
利用箭头辨认电极、胶槽与制胶组件，再按正文核对上样孔朝负极以及DNA迁移方向。图中设备仅为结构示例，不能照搬电源旋钮、尺寸或电压。来源为Addgene技术教程局部图，非商业推广。
Addgene Agarose Gel Electrophoresis：Labeled gel electrophoresis equipmentAddgene版权技术教程局部摘录，未据此声明开放许可；非商业推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 对每份 PCR 样本分别混合 5 μL 样本、5 μL 水、2 μL 6×上样液，轻吹打 3–5 次。NTC 同样取对应反应液配制，不用清水冒充过程阴性对照。
- P20 新头先上 ladder 5 μL。枪头伸入缓冲液、悬在孔口上方，缓慢排液，看到溶液沉入孔内再移开；不要用枪头探孔底。每份样本换头，上 10 μL，按泳道图立即打勾。
观察枪头与胶孔的位置；正文上样时避免戳破胶底、漏到缓冲液或挤入相邻孔。照片是原教程示例，不代表本篇样本、上样量或实验结果。来源为Addgene技术教程，非商业推广。
Addgene Agarose Gel Electrophoresis：Loading gel imageAddgene版权技术教程局部摘录，未据此声明开放许可；非商业推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 擦干电源外部，盖好槽盖再接电；红端接正极，DNA 从黑端向红端移动。按预先计算设置约 5 V/cm，启动后观察电极处少量气泡及染料向远离加样孔方向移动。
Addgene原教程第三幅照片：观察运行进度；不凭照片估计DNA片段长度。开盖、触碰胶槽或调整接线前必须先停电并断开电源。
- 运行 2–3 分钟检查一次方向和漏液，之后每 10–15 分钟观察。若染料向孔背后移动、缓冲液明显发热、剧烈起泡或电流突变，先停电再查接线与缓冲液，不在通电时伸手调整。
- 当前沿示踪染料约到胶长 75%–80% 时停止，通常 40–70 分钟；不等到小片段跑出胶才停。关闭电源并拔出电源端插头后再开槽盖取胶。
- 在专用染色盒配 100 mL 后染液：向 100 mL 1×TAE 加入 5 μL、10 mg/mL EtBr，轻摇混匀。胶完全浸没，室温低速摇动 20–30 分钟；不把 EtBr 原液带回常规配液区。
- 将染液倒入 EtBr 专用废液桶，用约 100 mL 水轻摇洗胶 5 分钟；这份洗水亦按染料废液管理，不直接入下水道。
- 在带防护罩的成像仪中放胶，关闭罩后开启 UV。选不过曝曝光时间，保存原始全胶图、曝光参数及泳道图；拍完关闭 UV 再开罩取胶。
- 依据该批 ladder 标称大小估算产物长度，检查阳性泳道和 NTC；废胶、枪头及手套按机构 EtBr 规范处置，清洁设备并记录实际运行电压、时间和液温异常。
09结果判断与质控
合格图像应有分开的 ladder 条带，阳性对照在预期位置，NTC 无同大小产物。一个约 1 kb 条带只能支持长度相近，不能证明序列正确。若 ladder 也完全不可见，先检查染色、光源与成像，不立即认定所有 PCR 失败。若所有泳道弯曲、拖尾或过曝，该胶不能用于可信的半定量比较；保留全胶原图，调整后重跑。
10实验记录模板
| 胶号/日期 | 胶浓度 | TAE 批号 | 梳子孔容量 | 电极间距 cm | 电压 V | 运行 min | 后染 min | 原图文件 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 1% | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
| 泳道 | 样本编号 | 原样体积 μL | 上样体积 μL | 预计 bp | 观察 bp | 异常 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 5 | 10 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
条带呈笑脸
先查电场过强、缓冲液过热或盐含量过高；降低电场并使用新鲜同体系工作液，必要时减少样本量。
样本漂在孔口
确认上样液为 1×、不是把 6×误当即用型；同时查孔破损和枪头喷气。
无条带而 ladder 正常
优先查上样是否漏孔、模板量、PCR 阳性对照及片段是否跑出；不要无限加长曝光来制造信号。
多条带
可能是非特异扩增或模板构象差异；本教程针对线性 PCR 产物，未经线性化质粒不能只按一条 ladder 位置判大小。
12参考资料
- Addgene：Agarose Gel Electrophoresis：已核对制胶、6×上样液比例、EtBr 后染 100 mL 加 5 μL 及水洗时间；本例把胶规模缩至 50 mL，电场另按电极间距限定。
- 电泳槽、成像仪和本批 ladder 说明书决定硬件上限、光源及条带标尺；EtBr 以现用批次 SDS 和机构处置规范管理。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。