RNA 提取与质控：GeneJET 培养细胞柱法完整示例

02实验原理

RNA 容易在取样、储存和提取过程中降解。提取步骤通常包含裂解、分离、洗涤和洗脱，不同体系不可混用。光谱比值主要提示部分杂质，不能代替完整性测定或特异的 DNA 污染评估。

04材料与仪器

• 已知细胞数的 NIH/3T3 沉淀，GeneJET K0731，96–100%分子生物学级乙醇，2 M DTT，无核酸酶水。
• RNase-free低吸附管、过滤枪头、P20/P200/P1000、冰盒、涡旋仪；必要时有防气溶胶装置的转子匀浆器。
• 可设250×g、14000×g及≥12000×g的离心机和兼容转子。本文均为RCF相对离心力，不是rpm。
• EN0521 RNase-free DNase I及配套10×buffer、50 mM EDTA；去DNA清理需额外一套GeneJET柱。
• 核酸定量仪、经验证的RNA完整性测定平台；上机芯片/试剂按所选平台建立程序，本篇不混用不同平台的上样配方。

05配液与用量

裂解液和洗液为厂商专有体系，不能把未知组成写成自配盐浓度。含胍废液不得与漂白液、酸等直接混合，按 SDS 收集处理。

06时间安排

07开始前的准备

清洁 RNase 操作区，更换手套，仅使用无 RNase 耗材。核对两瓶洗液是否已加乙醇，未加前不得开始；用表中 K0731 体积补充并标日期。裂解液若有盐析，37°C 温热至溶解后冷回25°C再加DTT。准备两支50 μL洗脱收集管并编号，离心机用×g模式或依据该转子半径换算，不把12000×g直接设为12000 rpm。样本沉淀若来自未明确生物安全等级材料，先落实本机构要求；本例只接受来源清楚的普通细胞。

08逐步操作

1. 核对细胞沉淀编号和约1×10⁶细胞输入记录。若仍在PBS中，250×g离心5分钟，小心吸去上清；残余培养基应在采集时用PBS洗去。本例从沉淀开始，不重新用胰酶处理。
2. 现配裂解液：取1000 μL GeneJET Lysis Buffer，加20 μL 2 M DTT，混匀；向细胞沉淀加600 μL此混合液，立刻涡旋10秒，令沉淀完全散开，没有干块贴壁。
3. 观察黏度。若仍黏稠、拉丝或明显不均，用适配转子匀浆器约30秒至均匀；若看到细胞碎屑，14000×g离心5分钟，将上清转入新无RNase管，不带走沉淀。不能靠硬压枪头强行把团块送上柱。
4. 向澄清裂解液加入360 μL 96–100%乙醇，P1000缓慢吹打约10次混匀，不离心弃沉淀。本例总体积约960 μL。
5. 将GeneJET柱放在随附收集管，先加700 μL混合液，室温12000×g离心1分钟；倒掉流出液，柱放回同收集管。若所用转子额定允许，12000×g满足手册“≥12000×g”要求。
6. 将剩余约260 μL全部加到同一柱，12000×g离心1分钟；丢弃流出液及旧收集管，把柱移到新2 mL收集管。样本未完全通过时先复核是否过载或堵柱，不直接进入洗脱。
7. 向柱中央加入700 μL已加乙醇的Wash Buffer I，12000×g离心1分钟；倒掉流出液，再把柱装回收集管。
8. 加600 μL已加乙醇的Wash Buffer II，12000×g离心1分钟；倒掉流出液，装回柱。
9. 加250 μL Wash Buffer II，12000×g离心2分钟，倒掉流出液。若柱内仍见残液，再空转1分钟，采用设备及柱许可的最高转速；未确认转子/柱上限时不要盲目加速。
10. 把柱移到标记好的无RNase 1.5 mL管；开盖时不要碰膜。将50 μL无核酸酶水准确滴在膜中央，室温12000×g离心1分钟，收集洗脱RNA并立即放冰上。本例不做第二洗脱，避免稀释。
11. 用与洗脱相同的无核酸酶水作空白，再按定量仪要求测RNA浓度及A260/A280、A260/A230，记录仪器下限和样本是否在范围内。低浓度不据不可靠比值做“合格”结论，改用RNA专一荧光法。
12. 按已建立的完整性平台检查一份小分装，保留电泳图或完整性报告。普通细胞RT-qPCR教学可预设完整性评分RIN≥7作为本批参考标准；不是所有样本/平台通用阈值。明显降解样本停止跨组表达比较，追查采样与RNase污染。
13. 如用于后续500 ng输入的RT教学，从本批RNA取5 μg做DNase处理，使用官方每1 μg配10 μL的比例放大5倍。示例RNA浓度200 ng/μL时，依次加水15 μL、RNA25 μL、EN0521配套10×buffer5 μL、DNase I5 μL，总50 μL，轻混匀，37°C孵育30分钟。RNA浓度不同则用5000/浓度（ng/μL）计算取量，水量=40−RNA体积；水量小于0时先按手册同比放大，不缩减buffer。若不足5 μg，可以按官方1 μg/10 μL小体系操作，但50 μL清理洗脱后的浓度预计更低，后续RT必须统一降低RNA输入或重新浓缩。
14. 向上述50 μL消化液加5 μL 50 mM EDTA，混匀后65°C孵育10分钟灭活；EDTA不可省略，因为有二价离子时加热可能损伤RNA。此55 μL产物尚含EDTA，不直接当成干净RNA进入后续教学RT。
15. 用同品牌新柱清理：向55 μL处理液加45 μL水至100 μL；加300 μL不含DTT的原始Lysis Buffer，混匀，再加180 μL乙醇并混匀，总580 μL。全部上新柱，12000×g离心1分钟，弃流出液并换新2 mL收集管。
16. 依次用700 μL Wash Buffer I洗1分钟、600 μL Wash Buffer II洗1分钟、250 μL Wash Buffer II洗2分钟，各次均为12000×g，且每次倒掉流出液。若仍见残液按第9步再干燥；换新收集管，用50 μL水洗脱，12000×g离心1分钟，冰上保存。
17. 重新测清理后浓度、总量及必要的完整性指标，不能沿用清理前浓度。每份取5–10 μL分装，当天上RT置冰上；需保存则−70°C或−80°C，标位置和冻融次数。用No-RT检测残余gDNA，阳性时先处理污染再解释表达结果。

09结果判断与质控

应获得来源和输入量清楚、无明显降解且残余DNA受控的RNA。纯RNA A260/A280常接近2.0，A260/A230常约2.0–2.2，但这些仅作杂质线索，不能替代完整性和No-RT。总量（μg）=浓度（ng/μL）×实测体积（μL）/1000。DNase后清理会损失部分RNA，不把第一洗脱总量当成最终RT输入量。本例不承诺每个细胞批次固定产量。

10实验记录模板

11常见问题与排错

柱子堵塞

先查细胞过量、裂解不全和黏稠度；本例1×10⁶不应被随意扩大为1×10⁷。出现明显堵塞应记录并重取适量样本，而非延长到任意高转速。

低A260/A230或RT受抑制

查乙醇是否加错、洗涤是否漏步、膜是否干燥；按清理路线处理后重新定量，不能只靠增加RNA体积。

No-RT有信号

核查是否为gDNA、引物二聚体或已扩增DNA污染，复查DNase活性与引物特异性；No-RT合格之前不报告目标表达倍数。

RNA降解

检查采样等待、RNase污染、冻融和EDTA步骤；不可通过调整吸光比值宣布降解RNA恢复。

12参考资料

• GeneJET RNA Purification Kit，MAN0012664 官方手册：已核对K0731预加乙醇、DTT补充、培养细胞路线（11–12页）、DNase（17页）和cleanup（18页）。
• 完整性RIN≥7为本教学预设适用条件；真实课题应按下游用途制定标准。