01本篇适用条件
本例是普通 Taq DNA polymerase、含 MgCl₂ 的配套 10×缓冲液，不是高保真、热启动或 2×预混体系。模板为已纯化非感染性教学 DNA，目标约 1 kb；使用已验证能在 55°C 退火的教学引物对，并预先持有其序列和预计产物长度。教程不凭空指定适用所有 DNA 的引物序列；没有匹配引物、阳性模板及产物长度资料时，先由指导者提供，经确认再开做。Taq 产物不适合未经测序直接用于要求无错误的构建。
02实验原理
PCR 通过变性、引物退火和延伸循环扩增目标 DNA。退火条件依引物与酶体系，延伸时间依目标长度和酶速率，不能仅凭通用模板固定所有温度与时间。
原图完整保留PCR循环与扩增示意。它用于理解分子过程；本篇温度、时间与循环次数以已限定Taq和模板的正文程序为准。
03安全与适用范围
佩戴实验服、手套和护目镜。核酸染料、裂解液及电泳设备按试剂 SDS 与机构 SOP 使用；接触样本后更换手套。人源及动物来源样本还需符合相应生物安全与伦理要求。
04材料与仪器
- 5 U/μL 普通 Taq 及其含 MgCl₂ 的 10×buffer，10 mM each dNTP mix；不要把“总 dNTP 10 mM”当成“每种 10 mM”。
- 一对 10 μM 引物，5 ng/μL 待测教学 DNA 与独立已知阳性教学 DNA，无核酸酶水。
- P20/P200、过滤枪头、冰盒、4 支 PCR 管、共享液管、带热盖的 PCR 仪。
- 扩增后区域的 1% 琼脂糖电泳设备，1 kb ladder、6×上样液与成像仪。
05配液与用量
| 组分 | 储备液 | 单管 50 μL 用量 | 终浓度或用量 |
|---|---|---|---|
| 无核酸酶水 | — | 36.8 μL | 补足体积 |
| 配套 Taq buffer，已含 MgCl₂ | 10× | 5 μL | 1×；Mg²⁺终浓度由该配套缓冲液标签确定 |
| dNTP 混合液 | 每种各 10 mM | 1 μL | 每种各 0.2 mM |
| Forward primer | 10 μM | 2.5 μL | 0.5 μM |
| Reverse primer | 10 μM | 2.5 μL | 0.5 μM |
| Taq polymerase | 5 U/μL | 0.2 μL | 1 U/反应 |
| 教学模板 | 5 ng/μL | 2 μL | 10 ng/反应，0.2 ng/μL |
| 合计 | — | 50 μL | NTC 用 2 μL 水替模板 |
做 S1、S2 两管待测模板，P 一管已知阳性，N 一管 NTC。为避免单独吸取 0.2 μL 酶，配 5 份不含引物和模板的共享液：水 184 μL、10×buffer 25 μL、dNTP 5 μL、Taq 1 μL，合计 215 μL。每管分装 43 μL，余 43 μL 为损耗余量；每管再加两种引物各 2.5 μL、模板或水 2 μL。四管均用同一引物对，禁止将不同目标混在这一配方里。
06时间安排
| 阶段 | 温度 | 时间/循环 |
|---|---|---|
| 配制 | 冰上 | 20–30 分钟 |
| 初始变性 | 94°C | 2 分钟 |
| 循环变性 | 94°C | 30 秒 |
| 循环退火 | 55°C | 30 秒 |
| 循环延伸 | 72°C | 2 分钟 |
| 上述三步 | — | 共 30 个循环 |
| 最终延伸 | 72°C | 5 分钟 |
| 结束保持 | 4°C | 尽快取出，非长期存放 |
07开始前的准备
在前扩增区清洁台面、更换手套，水、引物、酶和管均不接触已扩增产物。核对两引物序列、目标区间、Tm 和预期约 1 kb 产物；55°C 是此教学引物对验证后的条件，换引物后须重新验证。若引物原液为 100 μM，各取 10 μL 加水 90 μL 制成独立 10 μM 工作液，充分混匀；不能按干粉总质量猜浓度。PCR 仪选择 50 μL 体积和约 105°C 热盖，并核实管型兼容。
08逐步操作
- 在 PCR 管盖及侧壁标 S1、S2、P、N，分别表示待测重复、已知阳性和无模板。记录原模板浓度；把阳性模板与 NTC 加样位置分开。
- 将水、buffer、dNTP 和引物完全解冻，轻涡旋约 3 秒并短暂离心使液体回到底部，随后置冰上。Taq 最后取出，轻弹混匀，避免长时间室温暴露。
- 在共享液管依次加 184 μL 水、25 μL 10×buffer、5 μL dNTP，最后加 1 μL Taq。每次换头，沿液面下缓慢吹打约 8 次混匀，避免气泡；短暂离心后冰上待用。
- 给每支 PCR 管各加 Forward 2.5 μL、Reverse 2.5 μL。两种引物分别勾选，不把“共 5 μL 引物”误解为每种 5 μL。
- 给四管分别加 43 μL 共享液，保持共享液均匀。每管此时为 48 μL；若实际可分装量明显不足，停止复核配方，不用水随意补偿遗漏组分。
- 先向 N 加 2 μL 无核酸酶水并立即盖紧，随后 S1、S2 各加 2 μL 待测模板，最后 P 加 2 μL 阳性模板。每次换新过滤头并在板图打勾。
- 轻弹管底或缓慢吹打 5 次混合，盖紧后用适用微量离心机脉冲 3–5 秒收液；确认管内无明显气泡、各管液量一致，管壁无悬滴。
- 在 PCR 仪输入表中程序：94°C 2 分钟；94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 2 分钟共 30 循环；72°C 5 分钟；4°C 保持。逐行复查循环框只包含中间三步，不把初始变性重复 30 次。
- 设置反应体积 50 μL，确认热盖启动后放管并关闭仪器，保存程序名和开始时间；上机后不要反复开盖查看。
- 结束后将管送到后扩增区，在此开盖；前扩增区的枪头、管架和试剂不再接触这些产物。若暂不电泳，当天置 4°C，较长等待分装置 −20°C。
- 每管取 PCR 产物 2 μL、水 8 μL、6×loading dye 2 μL，共 12 μL，混匀后上 10 μL 到 1% TAE 胶；ladder 按该批说明量上样。泳道固定为 ladder、P、S1、S2、N。
- 按电泳教程运行并采集不过曝全胶原图，比较预期约 1 kb 位置。S1/S2 一致、P 有目标条带且 N 无相同大小条带，才记为本批扩增有效。
- 若 P 无目标带或 N 有目标带，停止解释待测结果；标记该批无效，分别排查程序/组分与污染后重新配反应。保留失败原图，不把失败对照从图中裁掉。
09结果判断与质控
本教学的成功终点是有效对照下获得预期大小、重复一致的主要条带。NTC 干净不代表绝无污染，单条带也不证明序列正确；后续构建或身份判断需测序。非特异条带或明显二聚体时先调整退火条件并重新验证，不仅截取希望看到的那一条。缓冲液中 Mg²⁺ 属厂商特定组成，未有瓶签数据时不能在记录中编造其数值。
保留泳道2、1、M及完整图例。该图比较DIG标记和未标记190 bp NGF探针，标记会改变表观迁移；这不是RNA完整性图或本篇教学PCR结果，不能凭此判定本篇片段大小。
保留三条泳道及图例。原文dd-PCR指差异显示PCR，不是数字滴度PCR；该旧方法的放射自显影不作为本篇操作推荐，也不由条带亮度推算RT-qPCR相对表达。
10实验记录模板
| 日期/批号 | Taq及buffer批次 | Mg²⁺标签浓度 | 引物名称及序列附件 | 预计 bp | 程序文件 | 原胶图 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 记录标签或未公开 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
| 管号 | 模板编号 | 浓度 ng/μL | 加入 μL | 产物大小 | NTC/P是否合格 | 判定 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S1/S2/P/N | 待填 | 待填 | 2 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
目标条带缺失
先看 P：P 也失败时检查仪器程序、是否漏加酶或引物以及试剂冻融；P 正常时再查待测模板及抑制物。
NTC 有相同大小条带
本批暂停结论，清洁前扩增区、更换水和引物工作液，重新做 NTC；不要通过提高循环数掩盖污染。
多条带或小分子条带
核对引物匹配，在小规模温度梯度验证更高退火温度；一次只改一个因素。本文不默认追加 MgCl₂ 或 DMSO，因为那会改变现有体系。
12参考资料
- Addgene：Polymerase Chain Reaction：已核对 50 μL Taq 分组分表、94/55/72°C 教学程序及 25–30 循环范围。本例固定 30 循环，按四管需求配五份共享液，未把原文多引物场景误作所有引物可共混。
- 实际 Taq/10×buffer 标签必须确认酶活、MgCl₂组成与兼容性。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。