01本篇适用条件
非致病BY4741（ura3缺陷）和无害非必需HO教学位点；起始为指导者提供的已测序HO同源臂-loxP-kanMX-loxP敲除片段，1 μg/15 μL。使用pSH47（URA3、GAL1-Cre）回收标记。本篇不涉及病原菌、增强性状或未知必需基因。
02实验原理
两侧同源序列促使替换靶位点；同方向loxP间重组移除kanMX，留下一个loxP疤痕。G418敏感仅提示标记丢失；需两端连接处和跨位点PCR/测序确认，同时清除pSH47，避免后续多个loxP间重排。
原Figure 1完整保留两个同向loxP、TEF2启动子与终止子、kanMX及载体位点。它说明敲除盒结构；具体引物和靶点必须按实验所用菌株序列设计。
03安全与适用范围
仅用身份明确的非致病实验室样本；穿实验服、戴手套和护目镜，由熟悉本法的指导者带教。先核对仪器量程、试剂SDS及废物收集容器；培养物按本单位微生物废物流程处理。不得把本例直接外推到临床、感染性或未知来源材料。
04材料与仪器
- BY4741、已验证HO敲除片段、pSH47、YPD、SC/-Ura、20%半乳糖、G418100 mg/mL储备液、1 M LiAc、50% PEG3000、10×TE、热变性10 mg/mL单链载体DNA。
- 30/42°C设备、离心机、PCR/电泳与测序；事先经验证的两端连接处及跨HO位点引物。
05配液与用量
| 项目 | 本例配制/用量 | 核对点 |
|---|---|---|
| 每次转化共452 μL | 细胞50 μL、DNA15 μL、50%PEG3000 300 μL、ssDNA7 μL、1 M LiAc40 μL、10×TE40 μL | PEG约33.2%；LiAc约88.5 mM，未计细胞内原液 |
| 0.1 M LiAc10 mL | 1 M LiAc1 mL+水9 mL | 无菌；现配 |
| YPD/G418100 mL | 100 mg/mL药液500或200 μL加入已冷却培养基 | 初筛500、复查200 μg/mL；固定同一盐型标示 |
| SC/-Ura+2%半乳糖10 mL | 不含糖SC/-Ura9 mL+20%半乳糖1 mL | 不用葡萄糖替代诱导糖 |
| 甘油保种1 mL | 培养物700 μL+50%甘油300 μL | 终15%甘油；−80°C |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 预计时间 |
|---|---|---|
| 敲除/选择 | 30°C | 约4–6天 |
| pSH47转化/选择 | 30°C | 约3天 |
| 诱导/敏感筛查 | 2%半乳糖30°C；复印平板 | 约4天 |
| 质粒清除/复核 | 非选择YPD | 约5–7天 |
07开始前的准备
先核对HO同源臂与亲本序列、loxP方向、PCR预期大小和亲本G418药敏。每轮转化设无DNA对照；与敲除阳性分开保留原始亲本。跨位点PCR须能区分亲本、含kanMX替换体和单loxP回收体，不能仅用kanMX内部引物。
原Figure 2保留模板、带同源臂引物、PCR产物、转化和整合后基因座全部节点。示意图不能代替两端连接PCR与测序验证；图中ORF及菌株为原例。
08逐步操作
- 新鲜单菌落入4 mL YPD，30°C通气培养16–24小时；次日稀释至10 mL、OD6000.1，再培养5–6小时至对数期。
- 3000×g室温离心5分钟，10 mL水洗；再以1 mL水转小管、同条件离心，用1 mL0.1 M LiAc洗一次。
- 沉淀重悬于200 μL0.1 M LiAc，每反应分50 μL，样本加15 μL含1 μg的HO敲除片段，阴性加15 μL水。
- 按表依次加入载体DNA、LiAc、TE和PEG，充分混匀2分钟；30°C振荡30分钟。
- 42°C热激15分钟，5000×g10秒收菌，去上清，重悬1 mL YPD。
- 30°C通气复苏3–4小时；5000×g1分钟收菌，100 μL水重悬，涂YPD/G418500 μg/mL，30°C2–3天。
- 挑10个单克隆到新YPD/G418200 μg/mL主板；检查两端连接处、靶ORF缺失和跨位点PCR，测序确认一个正确敲除克隆。
- 从正确敲除株新鲜培养物按步骤1–5再制转化，每50 μL细胞加15 μL含0.5–1 μg pSH47；无DNA对照平行。
- 该轮热激后以100 μL水重悬，涂SC/-Ura葡萄糖板，30°C2–3天，选择pSH47转化子。
- 取单菌落入3 mLSC/-Ura+2%半乳糖，30°C培养16–24小时诱导Cre；同株另做葡萄糖不诱导对照。
- 诱导液10 μL加90 μL水，取10 μL再加90 μL水继续稀释，选适宜稀释涂YPD，使形成分离单菌落，30°C2天。
- 挑5–10个克隆建YPD主板，次日按相同位置复印到YPD及YPD/G418200 μg/mL，30°C2天。
- 从主板取YPD长而G418不长者，做跨位点PCR及两端测序，确认kanMX移除且保留单loxP，不以药敏独自定论。
- 为清除pSH47，正确回收株入3 mL无选择YPD培养1天，取5 μL接3 mL新YPD再培养1天，重复一次。
- 末次5 μL培养液加100 μL水，取10 μL涂YPD；30°C2–3天分离后建主板，复印YPD和SC/-Ura，30°C1天。
- 选YPD长而SC/-Ura不长的克隆，再查G418敏感及跨位点基因型，记录敲除、标记移除、pSH47清除三个独立结论并保种。
09结果判断与质控
有效敲除：两端连接处正确、靶ORF符合预期；有效回收：G418敏感且跨位点大小/序列符合单loxP；有效清质粒：YPD生长且SC/-Ura不长。以上需与亲本和含标记对照并列，不能把单一阴性PCR当结论。
原Figure 3保留Cre质粒、半乳糖诱导、两个loxP重组及回收后的基因座。pSH47的URA3与kanMX是不同标记；切除验证和Cre质粒丢失验证须分别进行。
原Figure 4完整保留两块复印平板及标识，用于理解抗性标记丢失的表型。耐药消失仍须配合位点PCR；不能只凭一个未生长菌点认定成功切除。
原Figure 5保留整个凝胶、标尺、泳道编号及右侧标注。原研究菌株与位点是示例，本文预期条带大小必须用本次基因组、引物及剩余loxP序列计算，不照抄图中带长。
10实验记录模板
| 克隆/亲本基因型 | 片段同源臂/质量 | 初筛G418 | 两端PCR/序列 | 半乳糖诱导起止 | G418复印结果 | loxP序列 | SC/-Ura/质粒清除 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。
11常见问题与排错
无敲除菌落
查同源臂、DNA完整性、细胞活性与药敏，不随意降低选择药量。
诱导后仍耐药
查是否用葡萄糖培养、pSH47是否保留及loxP方向。
SC/-Ura仍长
继续非选择单克隆传代再筛；不要在保留Cre时开始下一轮敲除。
12参考资料
- 旧网络手册物理第75–77页：pUG6/loxP-kanMX-loxP和pSH47示意，原文只有链接，缺可执行转化/回收参数。
- Manipulating mRNA-binding protein Cth2 function in budding yeast Saccharomyces cerevisiae，2024，NCBI PMC10797207：已读452 μL LiAc/PEG体系、42°C15分钟、G418筛选、SC/-Ura+2%半乳糖16–24小时、药敏/PCR复核与连续YPD清质粒。本文把靶点限定为已预验证HO片段，不能照搬该文CTH2引物。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。