酚胍法总RNA提取：一皿培养细胞的分相、沉淀与洗涤

02实验原理

酸性酚/异硫氰酸胍裂解并抑制RNase，氯仿分相后RNA主要留在无色上水相；异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤。交界层携入会带来DNA、酚和蛋白，A260/280一项不能判定所有污染。

04材料与仪器

• TRIzol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、RNase-free水；至少2 mL耐酚胍/氯仿聚丙烯管与过滤枪头。
• 合规化学通风橱、4°C可达12000×g离心机、55–60°C热块、RNA定量与完整性检测条件。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

把试剂分相操作区与纯RNA区分开，预冷离心机、备好新管。记录细胞身份、数量、培养状态；吸走培养液后立即裂解，不让皿干燥。核对管耐化学性和离心额定值，准备含酚胍废液专用容器。

08逐步操作

1. 标记细胞样本S、空白B和对应水相新管，记录细胞数量与皿面积；更换清洁手套。
2. 在通风橱吸尽培养基，向皿中加1 mL TRIzol，多次温和吸排裂解并转至2 mL管；B直接加入1 mL试剂。
3. 室温20–25°C放5分钟，让核蛋白复合物充分解离，不立即跳到分相。
4. 各管加200 μL氯仿，拧紧管盖，充分手摇混匀约15秒，室温放2–3分钟。
5. 配平后12000×g、4°C离心15分钟；转子停稳后轻拿管，勿重新混层。
6. 观察无色水相、交界层与红色有机相；用细枪头由上向下吸取约400–500 μL上水相到新管，记录实取体积。
7. 每管加入500 μL异丙醇，轻混，室温静置10分钟；此加量按原始1 mL TRIzol确定。
8. 12000×g、4°C离心10分钟，记录沉淀位置；RNA可呈薄膜而非明显大块。
9. 远离沉淀吸去上清，加1 mL新配75%乙醇，短暂涡旋洗涤。
10. 7500×g、4°C离心5分钟，吸去乙醇；短暂收液后细枪头去残液，勿戳沉淀。
11. 在洁净RNA区室温开盖5–10分钟，以无明显游离乙醇但沉淀尚未变硬为终点，不用真空离心烤干。
12. 加30 μL RNase-free水，轻吸排，55–60°C孵育10–15分钟，帮助完全溶解。
13. 取独立小份测RNA浓度、A260/280和A260/230，另做适合RNA的胶或完整性分析；保留B读数。
14. 若用于RT-qPCR，另行进行经验证的DNase处理和清理，并设no-RT，不能认定TRIzol已经自动无DNA。
15. 报告RNA浓度×实际终体积所得质量；按每次用量分装−80°C，登记冻融次数，含酚胍废物密闭分类收集。

09结果判断与质控

应有可溶RNA且B接近检测背景。纯RNA A260/280常约2，但低浓度、溶剂和污染均会改变比值，不能凭比值定完整性或无DNA。产量须实测，不以细胞数强行推定。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

RNA不溶

查是否过度干燥，温和加热和延长浸泡，勿强涡旋长RNA。

A260/230低

优先查胍盐、酚与乙醇残留，必要时用适配RNA的方法再清理。

no-RT阳性

进行DNase处理并复核，不能通过修改阈值掩盖。

12参考资料

• 旧网络手册物理第134、136–137页及短版物理第2页：酚胍法线索；不采用未说明盐型配液或单一比值判断RNase污染。
• Thermo Fisher Scientific，TRIzol Reagent User Guide，Rev.D，物理第1–3页，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：已核1 mL/200 μL氯仿/500 μL异丙醇、12000×g、75%乙醇7500×g及55–60°C重溶。