LexA酵母双杂交定向验证：自激活排查与双报告判读

02实验原理

LexA融合蛋白结合报告启动子，互作把B42激活域带近启动子，启动LEU2与lacZ。bait自身转录激活、prey非特异结合和表达不足都可产生假象；LEU2生长与lacZ显色两个报告均符合对照才是候选证据，仍须独立生化/细胞方法支持直接互作。

04材料与仪器

• 已确认的5组EGY48三质粒株：bait+prey、bait+空B42、空LexA+prey、双空及同体系已验证互作阳性；每组至少3个独立单克隆。
• 不含碳源的10×合成培养基母液，终1×含YNB6.7 g/L及匹配dropout补充物；维护培养基缺His/Trp/Ura但含Leu；报告培养基另缺Leu。20%葡萄糖、20%半乳糖、20%棉子糖、2%琼脂、X-gal20 mg/mL。
• 30°C摇床/培养箱、分光光度计、无菌96孔板/移液器、独立划线平板、相同光照拍照条件。表达核查需抗LexA及适配B42融合蛋白检测。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

核对宿主、三个标记和每个载体启动子；本例pGilda与旧pLexA不同，必须如实记载，不能把Gal4-HIS3/3-AT筛选加入本LexA-LEU2路线。先在含Leu诱导培养基比较5组活性/毒性；显色平板必须先以报告阳性验证颜色，X-gal和缓冲条件不能仅靠称量就视为合格。

08逐步操作

1. 逐株核对EGY48和p8op-lacZ/pGilda/pB42AD身份、融合方向及测序，给五配对各三个独立克隆编号。
2. 各克隆分别划线在葡萄糖SD/-His/-Trp/-Ura维护板，30°C培养2–3天，检查能形成独立菌落。
3. 各取单菌落入3 mL葡萄糖维护液，30°C通气培养16–24小时；保持各组容器、液量和振荡条件一致。
4. 测OD600并拍培养状态，若某bait在维护或诱导条件显著抑制生长，先记录毒性，不将少生长直接判无互作。
5. 各取0.5 mL菌液，3000×g室温离心3分钟，以1 mL无菌水洗两次，去葡萄糖。
6. 重悬并接入3 mL含Leu的Gal/Raf选择液，使初始OD600=0.2，30°C通气诱导6小时，记录终OD。
7. 将各诱导菌液以水归一至OD600=0.2，按20+180 μL配10倍、100倍、1000倍稀释，不把不同密度直接比较。
8. 画板图，分别在葡萄糖维护板、Gal/Raf含Leu板、Gal/Raf缺Leu报告板及Gal/Raf含Leu+X-gal显色板点每梯度5 μL。
9. 点样完全吸收后30°C倒置；每天在同一光照/倍率拍全板，连续记录至第3–5天，不只拍最终最蓝一天。
10. 先确认五组在含Leu维护/诱导板有可比生长，已知互作阳性在缺Leu板生长且含Leu的X-gal板显蓝、双空低背景。
11. 检查bait+空B42：若缺Leu板生长或含Leu/X-gal板显蓝，标记bait自激活，暂停该bait的互作结论，考虑合理截短/更换检测体系。
12. 检查空LexA+prey与双空，若prey组也阳性，先排查非特异激活、交叉污染和标记错误。
13. 只有bait+prey相对两单边和双空均增加，且LEU2与lacZ同时符合预设判据，才登记为候选；保留葡萄糖非诱导照片。
14. 对候选与阴性核查LexA-bait及B42-prey表达，阴性但蛋白缺失不能解释为不互作；表达分析是独立验证任务，保存原始印迹。
15. 从原保种重新划线，以至少三个独立克隆重复；交换融合方向仅在表达与定位允许时作为另一验证，不把阴性反向实验强行解释。
16. 用独立互作方法继续验证候选，保存板图、逐日照片、菌株/序列和全部对照；报告培养条件、阳性判据和限制。

09结果判断与质控

双空和两个单边低背景、阳性有效且试验配对在独立克隆稳定激活LEU2/lacZ，才获得候选互作证据。论文图可展示自激活与表达对照，不作为本批配对成功数据。X-gal只定性/半定量，不能将蓝色深浅直接换算结合常数。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

全部不蓝也不长

先看阳性、Leu补回板与诱导糖；检查三载体是否保有及蛋白表达。

bait单独阳性

属于自激活，先重构bait或采用另一互作方法，不能直接减去背景声称阳性。

生长与显色冲突

复核板配方、lacZ显色条件及宿主背景；保留两报告原始结果，不选择性报告。

12参考资料

• 旧网络手册物理第113–133页，特别第119–128页：EGY48/pLexA/pB42AD/p8op-lacZ标记、Gal/Raf诱导、单边及LEU2/lacZ双报告对照；不采用旧病毒阳性蛋白或文库大规模扩增。
• Lin等，A tryptophan-rich peptide acts as a transcription activation domain，BMC Molecular Biology，2010，PMC2992532，查阅2026-11-02：已读全文方法、图1与图7；核对EGY48、pGilda-HIS3、p8oplacZ-URA3、LEU2/lacZ、自激活与表达验证，以及LexA-TFIIB/B42-W7同体系互作。Gal/Raf时间和X-gal板为旧法限定教学起点，须阳性与生长对照验证，不冒称该论文逐项验证本配液。