非致病大肠杆菌重组蛋白表达：10 mL诱导对照试验

02实验原理

IPTG解除lac调控，BL21(DE3)的T7聚合酶驱动pET表达。表达量和可溶性是两个问题；本篇先比较诱导与未诱导总菌体，后续分级纯化另见对应教程。不能从一条预期大小条带单独确认身份。

04材料与仪器

带已验证质粒的新鲜单菌落、灭菌LB、50 mg/mL卡那霉素无菌储液、100 mM IPTG无菌储液、50–125 mL透气培养容器、37°C摇床、分光光度计、计数用比色皿、可设×g的离心机、SDS-PAGE和蛋白定量设备。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

确认记录含宿主、载体、插入序列及抗性。先用LB空白校零OD600；高读数样本稀释后乘倍数。摇床转速为培养条件而非离心力，可从250 rpm、25 mm轨道作为本例通气设置；不同轨道要重新验证而非rpm换算成×g。

08逐步操作

1. 挑取新鲜单菌落至3 mL选择性LB，37°C透气摇动12–16小时；设无菌LB对照。
2. 第二天检查培养浑浊及无菌对照清亮，分别用200 μL种子接入两份补足至10 mL的选择性LB。
3. 两管同架37°C摇动培养，约2小时开始用空白校零测OD600，此后每30分钟测一次。
4. OD600约0.6时记录两管读数和时间，不让一管持续长到稳定期等待另一管。
5. 各取等量0.5 OD·mL作为诱导前基线：例如OD0.6取0.833 mL，10000×g离心1分钟，留菌体。
6. 为保持诱导规模，每组另备同条件10 mL培养液用于处理，或实测取样后剩余体积并按公式重新算IPTG。
7. 诱导组加100 mM IPTG至0.4 mM；10 mL实际体积加40.16 μL，对照加等量无菌水。
8. 继续37°C同条件摇动3小时，记录终点OD600及培养颜色；不把强绿色作为完整表达分析。
9. 终点两组分别按0.5/OD600 mL取菌液，使采集菌量相同，10000×g离心1分钟。
10. 弃上清，将每份沉淀重悬于50 μL水，加50 μL 2×SDS上样液，轻混并95°C加热5分钟。
11. 冷却后10000×g离心1分钟，各取10 μL上同一胶，另上分子量标准、基线和未诱导对照。
12. 完成SDS-PAGE与考马斯染色，比较预期融合蛋白大小处条带并保存未经裁切原图。
13. 用His免疫检测或其他身份方法复核；另取未加SDS菌体小份进入可溶性评估，培养废物灭活。

09结果判断与质控

报告诱导前后等菌量条带差异及预期分子量；表达不等同纯度、可溶性或活性。无菌对照混浊、载体身份不明或等菌量未做到时不能比较表达效率。

10实验记录模板

11常见问题与排错

无诱导条带：先核对宿主T7聚合酶、序列和抗性，保留未诱导对照。蛋白主要在沉淀：另设低温小试，不通过加大IPTG强行获得可溶性。两组条带全局不同：检查是否按OD·mL而非同体积上样。

12参考资料

旧来源：网络手册物理165–169页；短版12页。现代核对：EMBL Protein Expression and Purification Core Facility，Protein expression及E. coli expression，查阅2026-11-02，核对BL21(DE3)/T7匹配与菌株选择；诱导0.4 mM、37°C3小时来自旧文166页的明确小试条件，本文作为受限教学起点而非普适最优条件。