01本篇适用条件
用已纯化、已酶切的非感染性3 kb教学DNA片段：S/P含已验证500 bp 18S教学探针匹配区，N为相同总量且不含匹配区的片段。每道1 μg，5×5 cm带正电尼龙膜；DIG标记探针由指导者预制、纯化并做点样质量检验。不从人体取样。
02实验原理
DNA先按长度分离，碱变性为单链，再以高盐毛细转移至尼龙膜。DIG探针与靶片段杂交，抗DIG-AP结合后由CDP-Star发光。片段迁移需用线性DNA ladder估算，未切超螺旋不能作长度标准。
03安全与适用范围
NaOH腐蚀，SDS刺激；戴眼面防护，配液在合适防护区。烘膜使用隔热工具，防烫并确认尼龙膜耐温。无人体取材、感染样本或放射性核素；染料、碱液及含检测物废液分类收集。
04材料与仪器
- 线性教学DNA、DIG-18S500 bp探针、1%琼脂糖/1×TAE、20×SSC、1 M NaOH、5 M NaCl、2 M Tris-HCl pH7.5；带正电尼龙膜、滤纸和纸巾。
- DIG Easy Hyb、DIG体系10×封闭液、0.1 M马来酸/0.15 M NaCl pH7.5母液、anti-DIG-AP750 U/mL、25 mM CDP-Star；杂交炉、成像仪、80°C恒温烘箱。
- 配中和液用已标定2 M Tris-HCl pH7.5与5 M NaCl母液；马来酸缓冲液为100 mM马来酸/150 mM NaCl pH7.5，封闭、洗涤均明确使用该缓冲体系。
利用箭头辨认电极、胶槽与制胶组件，再按正文核对上样孔朝负极以及DNA迁移方向。图中设备仅为结构示例，不能照搬电源旋钮、尺寸或电压。来源为Addgene技术教程局部图，非商业推广。
05配液与用量
| 项目 | 本例配制/用量 | 核对点 |
|---|---|---|
| 碱变性100 mL | 1 M NaOH50 mL+5 M NaCl30 mL+水20 mL | 0.5 M NaOH、1.5 M NaCl |
| 中和100 mL | 2 M Tris-HCl pH7.5 25 mL+5 M NaCl60 mL+水15 mL | 终0.5 M Tris-HCl、3 M NaCl；25+60+15=100 mL |
| 低严谨洗液100 mL | 20×SSC10 mL+10%SDS1 mL+水89 mL | 2×SSC、0.1%SDS |
| 高严谨洗液100 mL | 20×SSC2.5 mL+10%SDS1 mL+水96.5 mL | 0.5×SSC、0.1%SDS |
| 5 mL杂交液 | 经定量DIG探针10 ng/μL取10 μL+Easy Hyb4.990 mL | 教学起点20 ng/mL；与点样检验联用 |
| anti-DIG-AP10 mL | 抗体1 μL+含0.015%SDS的1×封闭液9.999 mL | 1:10000；试剂标示750 U/mL时终75 mU/mL |
| CDP-Star1 mL | 25 mM原液10 μL+检测液990 μL | 0.25 mM；检测液0.1 M Tris/0.1 M NaCl pH9.5 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 预计时间 |
|---|---|---|
| 电泳/变性中和 | 室温 | 约3小时 |
| 转膜 | 20×SSC毛细 | 12–18小时 |
| 预杂交/杂交 | 50°C | 2小时+12–16小时 |
| 洗膜/免疫检测 | 室温/65°C | 约3小时 |
07开始前的准备
在纸上画泳道及膜切角；S/P/N各1 μg，阴性总DNA负载匹配。预先验证500 bp18S探针在50°C体系的特异性，其他GC含量/长度不得直接套温度。采用正电尼龙膜，80°C烘15分钟固定；该条件由BrightStar BioDetect固定说明核对，不用于硝酸纤维素膜。探针20 ng/mL为教学起点，须同批P/N验证。
原Figure 3保留缓冲液、支撑、滤纸桥、凝胶、膜、上层纸和重物的完整夹层及方向。本文检测教学DNA片段，原论文人体线粒体DNA取样和疾病分析不属于本文操作。
08逐步操作
- 将S、P、N和线性ladder加入1%琼脂糖胶，1×TAE中5 V/cm电泳，染料前沿接近胶下缘前停止。
- 保存完整胶图、标尺、泳道顺序及输入质量；修整含样品区域为约5×5 cm，左上角切小角定位。
- 3 kb片段不做酸脱嘌呤；胶置足量变性液，室温轻摇15分钟，换新液再15分钟。
- 用水短洗，胶置中和液室温15分钟，换新液再15分钟；同时裁膜、滤纸和略小于胶的纸巾。
- 膜先在2×SSC浸润1分钟；搭20×SSC液池与滤纸桥，滚去桥上气泡，胶孔面向下放在桥上。
- 在胶上放湿膜，切角对齐，排净气泡；依次放两张湿滤纸、约5 cm纸巾和约200 g平整重物。
- 胶四周铺隔液膜阻止纸巾直接接触液池，转移12–18小时，中途纸巾全湿时更换。
- 拆去上层，翻转胶膜组合，铅笔标孔位；揭胶后保留转膜后胶图，比较残余DNA。
- 在正电尼龙膜上标明核酸面，80°C烘15分钟固定；随后重润湿并进入杂交，全程避免杂交膜再变干。
- 膜放杂交瓶，加5 mL50°C Easy Hyb，50°C缓慢滚动预杂交2小时，保证膜完全接触溶液。
- 将DIG双链探针95–100°C5分钟、立即冰冷，加入新鲜5 mL杂交液，50°C杂交12–16小时。
- 室温2×SSC/0.1%SDS洗两次各5分钟；65°C0.5×SSC/0.1%SDS洗两次各15分钟。
- 马来酸缓冲液平衡2分钟，在含0.015%SDS的1×封闭液室温30分钟，再用预混1:10000 anti-DIG-AP孵育1小时。
- 以马来酸缓冲液含0.3%Tween20、0.015%SDS洗两次各15分钟，水短漂，检测液平衡3分钟。
- 核酸面朝上加1 mL0.25 mM CDP-Star覆盖1分钟，去多余液后塑料膜包好，37°C5分钟；成像多档曝光。
- 用P/N评估特异性，S应在约3 kb处有非饱和信号；按线性ladder的迁移距离复核长度，保留未裁剪图及失败对照。
09结果判断与质控
P在预期位置有信号、N无相应信号，S能结合胶图和转移后残留解释才有效。未见信号应先查探针点样、P和转膜，不能直接断言样本无目标；教学DNA不是定量基因组拷贝数实验。
原图2-9完整保留2、1、M泳道及图例，比较DIG标记与未标记的190 bp NGF DNA探针，标记可改变迁移。它是旧DNA探针质控例；本文若使用RNA或DIG-LNA探针，须用相应探针类型和阳性对照单独验证，不能将其当作本文RNA完整性或实测探针浓度。
原图2-8保留整条点样梯度。该图是随机引物标记DIG-cDNA的检测示例；本文若采用RNA探针，必须使用对应RNA阳性对照核对标记效率，不能从原图斑点反推本文的探针浓度。
原Figure 4完整保留1–6泳道选择、右侧1–4峰图和Area/Percent结果。原例为BamHI处理的人线粒体DNA，仅展示图像定量读法；本文教学片段不套用其生物结论，任意一条带占整图面积的Percent也不能直接当作样本相对拷贝数。
10实验记录模板
| 泳道/输入μg | 预期bp/胶图 | 膜型号/面积 | 转膜起止/残胶 | 固定能量 | 探针ng/mL/温度 | P/N与曝光 | 条带bp/异常 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。
11常见问题与排错
膜局部空洞
查气泡、折膜及液路短路。
整膜高背景
查探针游离标记、封闭、干膜和抗体过浓。
阳性也无信号
用点样检查探针和抗体体系，再核膜方向与转移。
12参考资料
- 旧网络手册物理第79–83页：Southern及毛细转移，不沿用放射标记路线或未定义固定时间。
- Analysis of human mitochondrial DNA content by Southern blot and non-radioactive probe hybridization，2019，NCBI PMC6581606：已读毛细转移12–18小时、200 g、18S探针50°C杂交、0.5×SSC65°C洗、anti-DIG-AP1:10000及0.25 mM CDP-Star；本文用纯化无害教学片段，探针浓度与本教学序列的杂交特异性为需正控验证的限定设置。
- Thermo Fisher Scientific/Ambion，BrightStar BioDetect Kit Protocol，Rev.B，2008-10-01，物理第13页：正电尼龙膜80°C15分钟固定。未使用未核实的120 mJ/cm² UV剂量。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。