酿酒酵母电转：EBY100的LiAc/DTT预处理与质粒转化

02实验原理

LiAc和DTT短时处理改善细胞可转化性，山梨醇提供渗透保护，低温洗涤减少电弧。现代EBY100方案为2.5 kV，旧法1.5 kV属于另一体系，不能在同一表中混用。

04材料与仪器

• EBY100新鲜单菌落、YPD、已确认支持trp缺陷选择的SD/-Trp葡萄糖培养基、1 M LiAc和1 M DTT母液、2 M山梨醇、1 M CaCl₂、经热变性的10 mg/mL鲑鱼精DNA。
• 2 mm电击杯、脉冲仪、冷冻离心机、30°C摇床及OD600仪。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

用新鲜小于4周工作板起始；预先确认亲本在YPD长、SD/-Trp不长。电转仪设指数衰减2.5 kV/25 μF/200 Ω，配2 mm杯。本文不采用现代论文中把pYD1阳性误称“negative”的措辞，也不按OD固定换算细胞数。

08逐步操作

1. 单菌落接5 mL YPD，30°C通气培养约7小时；全部转至95 mL新YPD，30°C继续约16小时。
2. 测OD600，目标1.6–1.8；未达目标按生长曲线处理，不能为赶时间直接收菌。
3. 4°C、2000×g离心4分钟，弃培养基，以50 mL冰水重悬；同条件离心，再重复水洗一次。
4. 用50 mL冰冷电转缓冲液重悬并按同条件离心，弃上清。
5. 以20 mL新鲜LiAc/DTT液重悬，转入摇瓶，30°C振荡20分钟。
6. 立即4°C、2000×g离心4分钟；用50 mL冰冷电转缓冲液洗一次，再离心去上清。
7. 加电转缓冲液使最终细胞悬液1.4 mL；冰上暂存，当天使用，记录实际体积。
8. 各杯取200 μL细胞，S/P加100 ng对应质粒和25 μg载体DNA；N/V以等体积水代质粒，所有组保留载体DNA。
9. 将混合液转入冰冷2 mm杯，冰上5分钟；擦干外壁、排除气泡，逐杯电击。
10. 设置2.5 kV、25 μF、200 Ω单脉冲，记录实际ms；V不电击，直接复苏。
11. 立即每杯加入1 mL冷山梨醇:YPD，转入含3 mL该液的管，再用1 mL该液冲杯并合并；目标最终约5 mL。
12. 全部处理后30°C通气复苏1小时；4°C、2000×g离心4分钟，以10 mL无菌水洗三次，去掉YPD。
13. 重悬于4 mL SD/-Trp葡萄糖液；S/P作1:50和1:100稀释各涂100 μL选择板，N同样上选择板，并取N与V各作相同梯度/体积上YPD板，比较电击后存活与未电击基线。
14. 30°C倒置3–5天，计数分离菌落；总转化子=菌落数×稀释倍数×4000/100，效率再除0.1 μg。
15. 挑独立样本菌落复划并做质粒/插入验证；记录阳性、阴性和存活对照结果，再安排后续培养。

09结果判断与质控

P在SD/-Trp生长、N不长、V在YPD生长才是有效批次。现代来源报道的高效率与文库条件有关，本例仅单质粒教学，不承诺10⁸ CFU/μg。四杯各200 μL仅消耗800 μL，余量留作损耗，不能把1.4 mL错误写成4×200 μL。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

电弧

查DNA盐、残培养基与杯外水；用新杯及去盐DNA重做。

选择板阴性也长

先查亲本trp表型和YPD残留，验证选择培养基。

存活板少

查DTT处理过长、脉冲异常及复苏渗透保护。

12参考资料

• 旧网络手册物理第69–70页：酵母电转线索，旧文将酿酒/毕赤选择混写，本文不沿用。
• High-Efficiency Transformation and Expression of Genomic Libraries in Yeast，2023，NCBI PMC10514863：已读100 mL、OD1.6–1.8、2000×g4分钟、LiAc/DTT20分钟、1 M山梨醇+1 mM CaCl₂、2.5 kV/25 μF/200 Ω及复苏选择。本文限定单个无害质粒。