01本篇适用条件
适用对象是第一次使用空气置换式移液器的操作者。本例仅用室温水和已经配好、标签明确的 10 mM NaCl 水溶液，不使用细胞、药物或危险样本。输出 S0–S5 六管梯度和 D 一管直接稀释液。稀释液无色，肉眼不能证明浓度正确；评价依据为计算、移液记录及称重。黏稠、易挥发或起泡样本不在此练习范围。
02实验原理
移液误差可传递到所有下游实验。C₁V₁=C₂V₂ 适用于浓度量纲一致、溶质量守恒的简单稀释；总体积 V₂ 包括母液体积，并不等于要加的溶剂体积。
03安全与适用范围
佩戴实验服、手套和护目镜。核酸染料、裂解液及电泳设备按试剂 SDS 与机构 SOP 使用；接触样本后更换手套。人源及动物来源样本还需符合相应生物安全与伦理要求。
04材料与仪器
- 有效校准且无漏液的 P20、P200、P1000 移液器和各自配套枪头。P20 用于 10 μL，P200 用于 100 μL，P1000 用于 900–1000 μL。
- 10 mM NaCl 水溶液至少 2 mL、实验级纯水至少 10 mL、7 支 1.5 mL 管、废液杯与记号笔。
- 读数到 0.1 mg 的天平、带盖称量容器、温度计。若只有 0.01 g 天平，只能粗查 1000 μL 转移，不能评价 10 μL 准确度。
05配液与用量
| 管号 | 本步加入液体 | 加入纯水 | 混匀后浓度 | 完成全部转移后的留存量 |
|---|---|---|---|---|
| S0 | 10 mM NaCl 母液 1000 μL | 0 | 10 mM | 900 μL |
| S1 | S0 100 μL | 900 μL | 1 mM | 900 μL |
| S2 | S1 100 μL | 900 μL | 100 μM | 900 μL |
| S3 | S2 100 μL | 900 μL | 10 μM | 900 μL |
| S4 | S3 100 μL | 900 μL | 1 μM | 900 μL |
| S5 | S4 100 μL | 900 μL | 0.1 μM | 900 μL，混匀后另弃去 100 μL |
| D | S0 原始母液 10 μL，另从母液瓶取 | 990 μL | 100 μM | 1000 μL |
S0 只承担串行转移；D 从原始母液另取，避免打乱 S0 留存量。每步总体积均为 1000 μL。NaCl 母液若已过期、无浓度或出现沉淀，停止并更换。
06时间安排
| 阶段 | 温度与时间 | 完成标志 |
|---|---|---|
| 核算、贴签与准备 | 20–25°C，10 分钟 | 七管对应表格 |
| 预加水与稀释 | 20–25°C，15–20 分钟 | 每管混匀后再向下转移 |
| 称重检查与整理 | 约 20°C，20–30 分钟 | 三次称重及计算完整 |
07开始前的准备
先写 1 mM = 1000 μM，1 mL = 1000 μL。S2 的累计稀释倍数是 10×10 = 100 倍，不是 20 倍。D 管核算：10000 μM × 10 μL / 1000 μL = 100 μM。将 S1–S5 的 900 μL 水及 D 的 990 μL 水分别画勾选格。检查枪头型号和移液器量程，禁止把旋钮拧到上下限之外；有裂纹、按钮回弹不顺或吸液后液面自行下降的仪器先停用。水与母液在台面平衡至同温。
08逐步操作
- 在管盖和管身分别写 S0、S1、S2、S3、S4、S5、D，另记日期及操作者；将管按顺序放在管架，未用管盖好。
- 用 P1000 设定 900 μL，装匹配枪头；用纯水吸排 3 次预润洗，水排入废液杯。读懂本型号第一挡和第二挡，再开始正式加液。
- 用同一清洁加水枪头向 S1–S5 各加 900 μL 水；枪头不碰管内液体和管壁污染处。每完成一管就在加水格打勾，若失去计数不要凭液面猜，倒掉该管液体重新加水。
- 给 D 管加 990 μL 水后盖好；换枪头，用 P1000 向 S0 加 1000 μL 母液，盖管并轻轻颠倒 5 次。
- 将 P200 设 100 μL，装新枪头，以 S0 溶液预润洗 3 次并排回 S0；垂直持枪，按钮压至第一挡才入液，枪头浸入约 2–3 mm，平稳松开吸液，停留约 1 秒再提起。
- 查看枪头内液柱有无气泡。若有气泡，将液体排回原管，换头检查接合后重新吸取；不要把有气泡的 100 μL 继续传给下一级。
- 将这 100 μL 排入 S1，沿管壁慢慢压到第一挡再压到第二挡；保持按钮压住，先离开液面再松开，避免把 S1 吸回枪头。弃头。
- S1 盖紧后颠倒 10 次；再用新头以 P200 吸排 5 次，每次 150 μL，使液体上下混合，避免只在表层搅动。混匀后才允许取 S1 做下一步。
- 按相同的“新头取 100 μL、排入下一级、弃头、充分混匀”动作依次完成 S1 到 S2、S2 到 S3、S3 到 S4、S4 到 S5，不跨管、不倒序。每次转移立即在记录表写时间和管号。
- S5 混匀后弃去 100 μL，使 S0–S5 最终均留存 900 μL。这个弃液动作不改变 S5 的浓度。任何一级若重复加样或漏混，停下，从该级及其后全部重做。
- 用 P20 新头从原始母液取 10 μL 加入 D，盖好颠倒 10 次，再用 P200 新头吸排 150 μL 共 5 次。D 与 S2 理论浓度相同，实际一致性需要电导等适合的方法检测，不能观察无色液体判断。
- 做独立称重检查：空称量容器加盖置天平去皮，P1000 取约 20°C 纯水 1000 μL 加入，盖回记录净增质量；重新去皮重复共 3 次，不把有盐的样本倒进称重水。
- 20°C 水密度约 0.9982 mg/μL，按“体积 = 净质量 / 0.9982”换算；1000 μL 理论质量约 998.2 mg。记录三次体积、平均偏差与重复性，和该移液器厂家容许误差比较。该练习不构成正式计量校准。
- 为各管写浓度、体积、溶剂和日期。练习液当天按普通盐水规定处理；清理枪头、把移液器恢复合适存放状态，签名保存原始记录。
09结果判断与质控
应能从 S5 倒推到 10 mM 母液，累计稀释 100000 倍；D 和 S2 均为 100 μM。成功要求包括每步都有记录、未发生漏混或错转、没有吸液气泡，称重结果符合本移液器说明书容许误差。三次质量接近只能说明本次大体积操作一致，不能证明低体积通道也准确。样本无色，最终浓度是根据正确配制推定而非已经化学测定。
10实验记录模板
| 日期/操作者 | 管号 | 来源浓度 | 来源体积 μL | 加水 μL | 理论浓度 | 混匀次数 | 异常与重配 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | S0–S5/D | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
| 移液器编号 | 水温 °C | 次数 | 净质量 mg | 换算 μL | 厂家容许误差 | 判定 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 1/2/3 | 待填 | 待填 | 查本型号 | 待填 |
11常见问题与排错
吸液后自行滴落
先换匹配枪头并检查安装；同一问题持续出现即停用该移液器，不通过加快转移掩盖漏液。
第三级加了两次母液
该管已经不是十倍稀释，所有后续管均失效。从该级新管开始重做，保留错误记录。
称量持续减小
检查蒸发、气流、容器是否加盖和天平是否稳定；每次排液后尽快按一致时间称量。
需要 0.1 μL 母液怎么办
不要强行用 P20；先算并配制合适中间液，让实际取样量进入校准范围，再重新计算溶剂体积。
12参考资料
- Eppendorf 移液技术资源；实际浸入深度、预润洗和容许误差以手头型号为准。
- 本文 NaCl 六级梯度及 D 管为教学算例，浓度和总体积逐项按 C₁V₁=C₂V₂ 核算；水称重为操作筛查，正式校准应采用适用计量程序。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。