酿酒酵母菌落PCR：NaOH热裂解后筛查教学位点

02实验原理

酵母细胞壁使直接挑菌扩增不稳定，NaOH配合加热释放可扩增DNA，粗裂解物也会抑制PCR。设置稀释可降低抑制，但同时减少模板，因此原液与稀释液并行；纯化DNA阳性不能单独证明裂解已成功。

04材料与仪器

• S288C教学单菌落4个、YPD复制平板、已确认同位点纯化DNA1 ng/μL。
• 20 mM NaOH、新水、GoTaq G2及Colorless液、10 μM已验证引物、dNTP。
• 100°C热块、额定20000×g的微量离心机、PCR仪、1.5%胶与100 bp梯。

05配液与用量

100 μM引物工作液以10 μL储备加90 μL水配成10 μM。N管共用混液按N×1.1份配，模板不加入混液；每管分24.5 μL再加0.5 μL模板/水。

06时间安排

07开始前的准备

先以纯化S288C DNA验证引物在58°C扩增500 bp，并准备已知可扩增菌落作为裂解阳性；若四个未知均不确定，需额外独立裂解已知株。本例对四个样本使用同一保守基因组位点，可用已知S288C菌落作裂解阳性。不可把此DNA阳性改成未经核对的高浓质粒。

08逐步操作

1. 对四个单菌落Y1–Y4拍照编号，在YPD复制板上对应格划线保种，记录其中已知裂解阳性株。
2. 五管各加50 μL20 mM NaOH，四管标Y1–Y4，一管B不加菌。
3. 新枪头分别轻触约0.5 mm菌点，涮入各管，盖紧；B用新头模拟操作但不接触菌。
4. 将密封管置100°C5分钟，计时从达到温度起算；取出室温冷却2分钟。
5. 20000×g离心1分钟，不扰动沉淀，将上层清液转新管；保留每管编号对应。
6. 各取2 μL上清加入18 μL水，配成1:10；B同样按原液取样作裂解空白。
7. 配11管25 μL PCR，逐管24.5 μL混液；标原液/稀释液八管及P/B/N，先分装不含模板混液。
8. N加0.5 μL水、B加0.5 μL裂解空白、样本加0.5 μL相应液，P最后加0.5 μL纯化DNA。
9. 运行95°C2分钟；30循环95°C30秒、58°C30秒、72°C30秒；72°C5分钟。
10. 各取5 μL产物加1 μL6×上样液，1.5%胶5 V/cm分离，保存完整胶图。
11. 对每个原液与1:10结果成对判读，记录稀释后是否恢复扩增；B或N有500 bp带则整批回查污染。
12. 阳性代表该片段可检出；如用于构建鉴定，另外设计跨接头引物并测序，单个内部基因带不能证明整合位置。
13. 按需从复制板获取对应活菌继续验证；处理热碱裂解废液和BSL1培养物，保存裂解起止、管图和判定。

09结果判断与质控

已知菌落裂解阳性与纯化P均应有500 bp，B/N无带。原液阴而稀释阳提示粗裂解抑制。需要证明“无靶标”时还应扩增独立内源位点，不能把无带等同基因缺失。

10实验记录模板

11常见问题与排错

只有纯化DNA阳性

检查菌量、加热、已知菌落裂解对照，必要时改纯化DNA；不无限加循环。

稀释才有带

说明抑制可能，记录最终稀释条件并独立重复。

接头带缺失

加内源对照分辨失败，再用纯化DNA和测序确认结构。

12参考资料

• 用户提供网络手册物理第30页：旧文仅列Lyticase及30分钟，缺酶活、缓冲液与模板量，本文明确替换成NaOH热裂解路线。
• 本古里安大学Tsirkas等，Enhanced fluorescent imaging of proteins in live yeast cells using fluorescently labeled scFv，STAR Protocols 2023，步骤6的菌落验证子步骤：实际全文核对少量酵母入50 μL20 mM NaOH、100°C5分钟、20000×g1分钟、0.5 μL上清入PCR。仅采用菌落裂解/验证，不引入其蛋白表达和改造过程。
• Promega，GoTaq G2 DNA Polymerase Product Information，9PIM784，修订03/18：已读50 μL体系、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM各dNTP、0.1–1 μM引物、约1分钟/kb延伸及25–30循环；本文按体积减半，保留相同酶浓度。