Western blot：NIH/3T3 的 β-actin 湿转教学流程

02实验原理

Western blot 先通过电泳分离蛋白，再转移到膜上，用抗体检测目标。条带大小、特异性和检测线性范围必须共同验证。曝光过度或加载对照不稳定会使后续归一化失去意义。

04材料与仪器

• 已标细胞数的NIH/3T3沉淀；配方中RIPA原料、无EDTA兼容的100×蛋白酶抑制剂、DTT、TBST原料、奶粉、BSA。
• Pierce BCA #23225（A液、B液），已配在同一RIPA中的2 mg/mL BSA标准储备液、562 nm酶标仪、37°C孵育设备。
• 10孔、1 mm厚、孔容量至少30 μL的10% Tris-glycine胶；预染10–180 kDa蛋白Marker、兼容电泳槽和电源。
• Mini Trans-Blot湿转槽、完整冷却装置、搅拌子、海绵、滤纸、0.45 μm硝酸纤维素膜、专用平镊和滚压工具；甲醇无需用于NC膜活化。
• 0.1% Ponceau S/5%乙酸即用液、抗体对、Pierce ECL #32106、化学发光成像仪、摇床、蛋白废物容器。

05配液与用量

甲醇有毒且易燃，配转膜液在合适通风条件下操作，勿放在点火源旁。RIPA先做BCA，之后才加DTT上样液；普通BCA不可直接测含高浓度DTT的样本。

06时间安排

07开始前的准备

确认抗体说明书及本地验证记录支持小鼠β-actin，记录货号、批次和预期分子量；已知阳性裂解物可用以前检测合格的NIH/3T3冻存裂解液。先做泳道图：Marker、阳性2.5/5/10 μg梯度、S1 10 μg、S2 10 μg、无一抗对照10 μg。S1/S2可为同一来源的技术演示，不能冒充独立生物学重复。无一抗泳道转膜后单独裁成竖条，之后不加一抗。RIPA和湿转液预冷，核对转膜槽电极距离、最大电压及本机验证记录；缺冷却、膜型号不符或电缆破损时停止。

08逐步操作

1. 将已收集细胞沉淀放冰上，加入200 μL新配含抑制剂RIPA，轻吹打约10次使沉淀分散，冰上裂解30分钟，每10分钟轻涡旋约3秒。若明显黏稠拉丝，需要先用该样本经验证的剪切方式处理，不能把未澄清团块直接上胶。
2. 4°C、14000×g离心15分钟，吸取上清到新预冷管，避开底部沉淀，记录回收体积，冰上保持。未加入还原上样液前取份做BCA，不把含DTT样品放进普通BCA。
3. 用2 mg/mL、同RIPA基质的BSA储备液配6点标准，各200 μL：分别取0、12.5、25、50、100、200 μL储备液，加同RIPA到200 μL，得到0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL。若标准液并非RIPA基质，先建立匹配的标准体系，不能默认任意溶剂无影响。
4. 样本先取12 μL上清加48 μL同RIPA，配1:5待测稀释液60 μL；每个标准和未知各做双孔，每孔25 μL。按实际孔数配BCA工作液A:B=50:1；本例16孔至少需3200 μL，配A3500 μL+B70 μL，共3570 μL。
5. 每孔加200 μL工作液，震板30秒，盖板37°C孵育30分钟，冷回室温后同批读取562 nm。扣空白，用合适标准曲线求样本稀释液浓度，再乘5还原原样浓度；超标准范围重配稀释度，不外推。

   

6. 本例后续要求原样浓度≥1 μg/μL。以RIPA将各裂解物统一到1 μg/μL，例如2 μg/μL原样取40 μL加RIPA40 μL；低于1 μg/μL时停止照抄20 μL上样方案，先验证较低统一质量或浓缩，不提高未知总上样体积超过孔容量。
7. 每管总20 μL制样：2.5 μg阳性用2.5 μL蛋白+7.5 μL RIPA+10 μL 2×上样液；5 μg用5+5+10 μL；10 μg用10 μL蛋白+10 μL 2×上样液。S1、S2及无一抗各为10+10 μL。最终DTT50 mM、上样液贡献SDS2%；计入样本RIPA带入的SDS后总SDS约2.05%，甘油10%。
8. 盖紧样品管，95°C加热5分钟，短暂离心收液，置室温备用。该加热条件针对β-actin教学样本，不能直接套给容易聚集的膜蛋白或多聚体目标。
9. 拆胶包装，按兼容电泳槽安装预制胶并去掉底部封条、拔梳。先用少量1×跑胶液冲孔，装槽后上室约200 mL、下室约600 mL工作液，实际以本设备刻度和不漏液为准，记录加入量。

   

   

10. Marker按本批推荐量（本例选择每泳道5 μL规格）上5 μL，各样本上20 μL，新头逐孔加。盖好后100 V恒压运行，约60–90分钟，示踪前沿距胶底约5 mm停止。若上室液面下降或条带弯曲发热，先断电检查，不让胶跑干。

    

    

    

    

11. 断电后拆胶，剪去无蛋白的梳齿区和底部余胶；在4°C转膜液中平衡胶10分钟，同时将与胶等大的NC膜及滤纸浸湿5分钟。NC直接用转膜液润湿，不照搬PVDF的甲醇活化动作。
12. 在装有冷转膜液的托盘中组装：黑色负极侧依次为海绵、滤纸、胶、NC膜、滤纸、海绵，NC靠红色正极。每加一层轻轻滚压，赶走胶与膜间全部气泡；用干净镊子夹膜边，写铅笔角标，不碰有效蛋白区。

    

    

    

13. 夹好转膜夹，按本设备方向装入湿转槽，加入约800 mL冷转膜液至规定液位，放本机匹配冷却装置并低速搅拌。本例在已验证Mini Trans-Blot组合上100 V转60分钟，维持低温，记录起止温度；冷却失效或温度持续异常升高先停机，不能只等满60分钟。

    

    

14. 关电并断开电源再取膜，以10 mL 0.1% Ponceau S/5%乙酸染5分钟，用水10–20 mL轻洗至背景变浅，拍完整总蛋白图及Marker位置。若局部大片空白、转反或严重不均，暂停抗体流程并排查，不拿后续曝光补救转膜失败。

    

15. 用水和TBST各洗至膜上红色基本消失。依泳道图将最后“无一抗”泳道裁为单独竖条。主膜用10 mL 5%奶粉/TBST，室温轻摇1小时；对照条另加2 mL同封闭液，保证均浸没、不贴盒底。
16. 主膜倒掉封闭液，加5 mL 1:1000兔抗β-actin一抗液，4°C轻摇12–16小时；对照条加2 mL不含一抗的5% BSA/TBST，同温同时间处理。记录液体实际覆盖，避免膜局部干燥。

    

17. 第二天分别弃去一抗液/对照液，主膜每次加10 mL TBST，室温轻摇5分钟后倒掉，连续3次；对照条每次2 mL，同样3次。使用新的洗液，不能只补液而不换液。
18. 加入5 mL 1:2000抗兔HRP二抗液孵育主膜，室温轻摇1小时。对照条另配2 mL同浓度二抗：二抗1 μL+5%奶粉/TBST1999 μL。所有容器不加叠氮钠，避免抑制HRP。
19. 按第17步再洗3次，每次5分钟。测量主膜与对照条总面积，本例不超过60 cm²，临用混合Pierce ECL液A3 mL+B3 mL，共6 mL，即约0.1 mL/cm²。将主膜与对照条有效面朝上并排放在平整洁净托面，夹边沥掉多余TBST后均匀加液，保证整个有效面持续被液体覆盖，室温反应1分钟；面积更大时按同一面积用量放大，不让膜干燥。

    

20. 将膜放到化学发光成像仪，按同一布局采5、15、30、60秒曝光并检查饱和提示，保存所有原始全膜图。若10 μg梯度饱和而2.5或5 μg仍在线性区，后续样本应降上样量重测；禁止对已饱和条带做可信倍数定量。

    

21. 检查约42 kDa条带、已知阳性、无一抗对照以及阳性梯度的单调关系；有多条同强信号时先确认特异性。β-actin在本例是被检测目标，不能再用自身作加载归一化内参；需要比较时使用经过验证的总蛋白归一化方法或独立稳定内参。

09结果判断与质控

本次成功需同时满足转膜分布均匀、阳性有约42 kDa主条带、无一抗对照无相应背景、所选曝光不饱和，且2.5/5/10 μg系列支持使用范围内的近似线性。单个正确大小条带不足以证明抗体绝对特异，必要时用敲除或其他独立证据验证。此处给的是明确、受设备和抗体批次限定的教学起始方案，不保证未验证设备和样本直接产生相同结果。

10实验记录模板

11常见问题与排错

膜上有圆形空白

优先查转膜夹气泡、滤纸折叠和膜润湿不足；保留Ponceau图，重新组装并验证，不靠增加抗体修复。

Marker转过去而目标没有信号

查阳性样本、一抗物种、二抗配对、HRP底物及叠氮钠污染；看总蛋白转移和阳性后再决定是否调整转膜。

背景高或白心条带

查上样过多、抗体浓度过高、洗涤不足及曝光饱和，优先用现有上样梯度和较短曝光定位问题；不要挑选局部图像遮盖背景。

想换成PVDF或另一台转膜仪

本教程NC膜及100 V参数不能直接沿用；重新确定活化、缓冲液、电极结构和转移效率，建立适用SOP后再做样本。

12参考资料

• Pierce BCA Protein Assay Kit 官方手册：已核对微孔板25 μL样本+200 μL工作液、A:B=50:1、37°C30分钟及562 nm读取。
• Mahmood & Yang：Western blot: technique, theory, and trouble shooting，PMC3456489：参考膜方向、抗体孵育与对照逻辑；本文不逐字采用其凝胶配制、电压或定量简化表述。
• CST β-actin #4970及抗兔HRP #7074：操作前核对现用批次资料和本地验证。本例RIPA、缓冲液、抗体稀释及湿转条件是明确的教学设计；转膜须满足正文设备与本机SOP限制。