01本篇适用条件
从已去盐、已定量且无颗粒的木豆叶教学蛋白提取物50 μg开始，使用7 cm、pH4–7的IPG胶条及兼容PROTEAN i12聚焦装置，二向为12%迷你SDS-PAGE。样本制备由指导者提供，不包含人源样本或有机溶剂植物抽提。需受过高压IEF和丙烯酰胺操作培训。
02实验原理
第一向按等电点聚焦，第二向在SDS中按表观分子量分离。高盐、过载、还原/烷基化不足与胶条接触气泡会造成拖尾。图像差异必须在同条件独立重复中验证，单张胶不能支撑差异蛋白结论。
03安全与适用范围
IEF为千伏高压，盖锁及接地必须有效，通电时不打开盘。尿素不加热，DTT与碘乙酰胺戴手套并在规定区域配制，碘乙酰胺避光；使用已灌12%胶避免本篇再次处理单体。
04材料与仪器
50 μg去盐木豆叶蛋白、7 cm pH4–7 IPG胶条、兼容水化/聚焦盘及矿物油、i12装置、电极纸、12%单一宽槽二向胶、尿素、CHAPS、IPG缓冲液、DTT、碘乙酰胺、Tris-HCl、SDS、甘油、低熔点琼脂糖、1×运行液与考马斯染色体系。
将灌胶或预制胶组件与完整槽体对应；图为特定型号外观，不用于推断其他设备的接线和装配方向。
05配液与用量
| 试剂 | 配量 | 核算/用途 |
|---|---|---|
| 水化液10 mL | 尿素4.805 g、CHAPS0.20 g、100%对应pH范围IPG添加液50 μL、1 M DTT0.50 mL、0.1%溴酚蓝20 μL，水补至10 mL | 8 M尿素/2%CHAPS/0.5%IPG添加液/50 mM DTT/0.0002%染料 |
| 上样 | 50 μg蛋白，以相同水化液补足至125 μL | 若原液2 mg/mL，取25 μL+100 μL水化液；原样需已在同基质 |
| 平衡基液10 mL | 尿素3.604 g、1.5 M Tris-HCl pH8.8 2.5 mL、SDS0.20 g、甘油2.0 mL；水补至10 mL | 6 M尿素/375 mM Tris/2% SDS/20%甘油 |
| 平衡I，1.5 mL | 基液中溶DTT30.08 mg并补足1.5 mL | 130 mM DTT，分子量154.25 |
| 平衡II，1.5 mL | 基液中溶碘乙酰胺37.46 mg并补足1.5 mL | 135 mM，分子量184.96，避光 |
| 封胶液10 mL | 低熔点琼脂糖50 mg，用1×运行液至10 mL | 0.5% w/v；少量溴酚蓝示踪 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间/程序 |
|---|---|---|
| 被动水化 | 20°C、125 μL/7 cm | 16小时 |
| IEF 1 | 线性升至250 V | 20分钟 |
| IEF 2 | 线性升至4000 V | 2小时 |
| IEF 3 | 4000 V保持 | 本阶段10000 V·h，约2.5小时 |
| 平衡I/II | 室温轻摇 | 各15分钟 |
| 二向 | 80 V进入胶后120 V | 前沿距底约5 mm停止，约1–2小时 |
07开始前的准备
先确认装置7 cm程序的单位：V、时间和V·h不可混淆。2024技术方法表1的Current列写50但未印单位，执行者必须在本机有效技术文件/界面确认其为每胶条电流上限50 μA并记录；若不能确认，不能启动该设置。温度20°C，绝非旧文水化−20°C。二向电流及温升由本机监测，不能用17 cm电流照搬到7 cm。
08逐步操作
- 记录蛋白来源、浓度与去盐方法，计算50 μg体积，准备125 μL无颗粒样本液，另保留输入小份。
- 将胶条密封袋室温平衡10分钟，确认7 cm、pH4–7、方向和有效期。
- 沿水化槽分布125 μL样本，去掉胶条保护膜，胶面朝下覆盖，轻提一端排尽气泡。
- 按盘的有效技术文件覆盖足量矿物油防蒸发，本例约1 mL能完全覆盖7 cm胶条；20°C被动水化16小时。
- 准备电极纸，以水少量润湿至均匀湿润但不滴流；将水化胶条装入聚焦盘并对准正负极。
- 确认胶条两端接触电极，补矿物油完全覆盖，盖好盘并锁盖。
- 设置20°C、经技术文件确认的每条50 μA上限及表列程序：250 V20分钟、4000 V线性2小时、4000 V累计该阶段10000 V·h。
- 启动后监测早期电流、实际电压与告警；若持续限流、无法升压或出现电弧，按仪器流程停机排查。
- 聚焦结束保存实际电压/伏时日志，断电后取胶条，让油沥去，不用滤纸压擦胶面。
- 胶条放1.5 mL新鲜平衡I液，室温轻摇15分钟；同时配避光平衡II。
- 取出胶条沥掉余液，转1.5 mL平衡II，避光15分钟；顺序先DTT再碘乙酰胺。
- 用1×运行液快速漂洗，胶条贴合12%胶顶部宽槽，推支撑膜使胶面完全接触，不压伤胶面。
- 加温热未烫手的0.5%封胶琼脂糖，排净胶条下气泡，静置约5分钟凝固，旁侧放适用分子量标准。
- 装槽检漏，80 V待蛋白进入分离胶后改120 V；前沿距底约5 mm断电，记录温升与总时间。
- 取胶切角标方向，按已验证考马斯方案染色、拍全胶原图，记录pH方向、标准及拖尾；需要鉴定时进入独立切胶教程。
09结果判断与质控
合格结果为可分辨的蛋白点，pH方向与分子量方向明确，无大面积水平拖尾或纵向条纹。低pH4–7范围不包含全部蛋白，缺点不能简单解释为不表达。各样本必须同量、同批胶条及程序并有独立样本重复才能比较。
Figure 2完整保留A快速硝酸银、B长程序硝酸银、C无醛银氨、D甲醛固定银氨全部四panel。原例9 μg大肠杆菌总蛋白，pH4–8第一向/10%第二向；不能用不同处理后斑点深浅直接作相对定量，也不表示四体系都兼容质谱。
原Figure 2完整保留A–H、pH方向、分子量标尺和放大区。A/B为250 μg，C/D为100 μg，E/F为50 μg，均pH3–10；G/H为50 μg、pH4–7，第二向均12%。两列比较C. cajan与C. scarabaeoides。本文从已备好的50 μg蛋白进入7 cm pH4–7 IPG，不把所有比较条件同时当作推荐流程。
原Figure 6完整保留四个图谱、A–D标识、pH方向及分子量标尺。A/B为两物种各250 μg叶绿体蛋白，C/D各50 μg，第一向均pH3–10、第二向12%，短程序银染。图中样本与本文总蛋白/pH4–7不同，不把这些斑点作为任意新样本的鉴定结果或质谱编号。
10实验记录模板
| 样本/μg/125μL组成 | 胶条pH/长度/批次 | 水化温度/起止 | 电流单位核验 | 各阶段实际V/V·h | 平衡I/II时间 | 二向温度/前沿 | 原胶图/拖尾 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
长期限流：优先查盐与核酸污染，不直接加高电压。水平拖尾：查水化溶解、过载与聚焦不足。纵向条纹：查平衡、胶条接触、气泡及油残留。旧图的“过聚焦/欠聚焦”只能是线索，须结合实际电压日志。
保留旧59页47同类诊断图在网络汇编中的完整纵向视野；上、下两panel展示凝胶表面及聚合不均现象。旧59文档缩短了图像视野，本图补足完整胶图；不推荐照抄旧文处理配方。
完整保留SDS结合不足、过载双panel和银染杂点的原胶图。它们来自二维电泳排错背景，不全部是同一种染色体系；仅用于比较可见异常，不能由外观确定唯一原因。凝胶浓度、负载、SDS和染色条件以本篇核实的流程为准。
四组原胶图及各自英文原因和处理建议全部保留，与短版46页末和47页首的四组图对应。网络版视野较完整，不重复收录纵向压缩版本。旧图最后一组对pH方向与过度或不足聚焦的说明存在含混，排错须结合真实条带方向和设备程序，不机械套用该句。
Figure 1完整保留A/B及所有箭头。A为HeLa 80 μg蛋白的快速硝酸银染色，B为分泌蛋白150 μg的银氨染色；均为pH4–8第一向/10%第二向。原图展示不同染色体系伪影，本文只采用硝酸银路线，不把银氨条件混入。
补充Figure S2完整保留A/B、pH3–10方向及条纹。原例各用100 μg C. scarabaeoides总蛋白或叶绿体蛋白，第二向12%；本文50 μg/pH4–7与其不同。此图用于识别优化前的拖尾与横条纹，不是本文预期结果。
12参考资料
旧来源：网络手册物理187–194、196页；短版41–47、51页。现代核对：PLOS ONE，Improved methods for total and chloroplast protein extraction from Cajanus species for two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry，2024-08-15，19:e0308909，方法Two dimensional SDS-PAGE及表1，查阅2026-11-02。采用7 cm、50 μg/125 μL、20°C16小时、250/4000 V程序、6 M尿素/2%SDS/375 mM Tris/20%甘油与130/135 mM还原烷基化体系。水化配方按旧文有效成分精确定容，二向用迷你胶监测；电流列缺单位的执行核验边界写明。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。