肿瘤细胞 Transwell 迁移：8 µm 小室从接种到膜下计数

02实验原理

上室用低蛋白悬液，下室用10%FBS培养液形成梯度；平行设上下室均为低蛋白液的无梯度对照。每条件至少3个小室作为技术重复，独立培养批次才是独立实验。8 µm孔径与上下室建议体积来自3422产品资料，细胞数、24小时和染色条件是明确的教学起点。

04材料与仪器

HeLa单细胞悬液；Corning3422小室6个及24孔板；EMEM、FBS、细胞培养级BSA、无钙镁PBS；商业4%甲醛固定液、Sigma结晶紫C0775；计数板、棉签、镊子、倒置镜与明场相机。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先用每室2.5万与5万活细胞、12与24小时做小范围预试；选择膜下细胞可分辨且未连成片的条件。正式实验固定细胞数和时间，预设每膜中心加四个周边视野，排除膜边缘，拍照倍率保持一致。用平行孔观察活率和增殖，避免把少迁移全解释为运动受抑制。

08逐步操作

1. 显微检查健康、未过密的HeLa；按本系列传代方法收获，计数后记录活率，教学目标≥90%，异常样本先查因。
2. 从完全培养基中收集所需细胞，200×g室温离心5分钟，以1mL上室液重悬一次，再同条件离心去血清，最后按表配至5×10⁵活细胞/mL；这些清洗参数是本例待验证设置。
3. 给3个梯度组下孔各加600µL完全培养液，3个无梯度孔各加600µL上室液，标明孔号。
4. 垂直放入3422小室，确认膜下无气泡，膜不接触孔底；出现气泡先重新放置，不带气泡接种。
5. 轻柔混匀细胞悬液，给每个上室加100µL，避免枪头碰膜；每室5×10⁴活细胞。
6. 将板水平放入37°C、5%CO₂培养箱，计时24小时；不频繁取出摇动，不额外往一组补培养液。
7. 终点先拍膜上细胞状态；小心吸去上下室液，用PBS沿壁轻洗一次，避免强力冲刷膜下细胞。
8. 将小室置于含600µL商业4%甲醛液的新孔，上室加入100µL同液，室温固定15分钟；随后上下表面以PBS温和洗3次。
9. 下孔加600µL、上室加100µL 0.1%结晶紫，室温染20分钟；用水温和冲洗至背景清晰，无明显游离染料颗粒。
10. 用湿棉签轻轻擦去膜上表面未迁移细胞，沿两个方向各擦一次，不能翻到膜下擦拭；用新棉签复查上面已清洁。
11. 保持同样朝向拍膜下5个预设视野，记录视野面积；计完整细胞或可辨细胞核，不计染料沉淀和孔影。
12. 每膜先算5视野均值，必要时除以视野面积报告个/mm²；再汇总3膜。保存全部图像、上表面清除情况和独立批次信息。

09结果判断与质控

梯度组应在预试中有可计数的膜下细胞，且无梯度组提供背景参考；背景不必为零。每视野20、25、30、22、23个的膜均值为24个/视野。只有固定视野面积后才能跨实验比较密度；接种数和活率不一致时不能直接归因于迁移。

10实验记录模板

11常见问题与排错

膜下无细胞：查气泡、细胞状态、膜孔径与观察面，再延时做预试，不能直接宣布迁移被抑制。膜下成片：减少细胞数或缩短时间重做，无法可靠分开时不硬数。结晶紫颗粒多：过滤染液并加强温和漂洗，拍图前区分孔影与细胞核。

12参考资料

• Corning：3422官方产品资料，8.0µm、6.5mm、推荐上室0.1mL/下室0.6mL，已读取。
• ATCC：HeLa CCL-2，已核对培养条件与BSL-2。细胞数、时间和染色法为本页教学设置，不是厂家对HeLa迁移性能的保证。