01本篇适用条件
本例适用状态良好的 ATCC HeLa CCL-2，一瓶 T75 约 70%–90% 汇合、无可见污染且支原体检测合格；采用 ATCC 30-2003 EMEM 加 10% FBS，37°C、5% CO₂。ATCC 对该株推荐 1:2–1:6 传代，本例选其中的 1:3。体积按 T75 写出，不直接套到 T25、6 孔板或其他 HeLa 亚株。
ATCC 原页解离液为 Trypsin-EDTA 30-2101，本例选该试剂；使用其他品牌或非酶解离液需要另行核对浓度和终止方法。T75 每瓶最终 15 mL、PBS 清洗 5 mL 是明确的教学设置。推荐先由受训人员带做一次；CCL-2 属 ATCC BSL-2。
02实验原理
本例先使一瓶细胞成为均匀悬液，再把来源相同的悬液等分到三瓶。传代比例只决定分走原瓶的多少，并不保证相同活细胞数，因此另取样计数并记录每瓶实际接种数。整套流程不额外安排离心，以免把其他株的沉淀条件拼进 ATCC 该株常规传代程序。
按曲线辨认迟缓、指数和平台生长期，并理解倍增时间来自指数阶段。此为通用示意，不是HeLa的实测生长曲线；不能从图读取本篇200细胞铺板或传代的等待天数。来源为ATCC技术指南，非商业推广。
03安全与适用范围
CCL-2按BSL-2操作，所有开盖、取样和终止步骤在Ⅱ级生物安全柜内进行。避免快速喷出悬液和含细胞气溶胶；台盼蓝样本进入指定化学/生物混合废物路径。
04材料与仪器
- 待传代 HeLa CCL-2 T75 一瓶，新的组织培养处理 T75 三瓶。
- 预温完全培养基至少 50 mL；D-PBS 至少 5 mL；指定 Trypsin-EDTA 至少 2 mL。
- 15 mL 无菌管一支、无菌移液管、移液器、计数板及0.4%台盼蓝。
- Ⅱ级生物安全柜、倒置显微镜、37°C/5%CO₂培养箱和计时器；本例不需离心机。
05配液与用量
| 项目 | 用量 | 计算或用途 |
|---|---|---|
| 完全培养基 100 mL | EMEM 90 mL + FBS 10 mL | FBS 终浓度 10% |
| 无钙镁 D-PBS（30-2200） | 5 mL/T75 | 清除血清，吸净后才加解离液 |
| Trypsin-EDTA（30-2101） | 2 mL/T75 | 落在原页 2–3 mL 范围内 |
| 完全培养基用于终止 | 8 mL | 原页范围 6–8 mL；收获液共约 10 mL |
| 计数取样 | 20 µL 细胞悬液 | 从约10 mL取出，不倒回 |
| 三支新 T75 各自预加 | 11.67 mL 完全培养基 | 可用 10 mL + 1.67 mL 分两次加入 |
| 各瓶接种 | 3.33 mL 均匀细胞悬液 | 11.67+3.33=15.00 mL/瓶 |
收获液约10 mL，取20 µL计数后约9.98 mL。三瓶各取3.33 mL需要9.99 mL，故为便于实际操作：计数后补入20 µL完全培养基恢复到约10.00 mL，再每瓶分3.33 mL，剩约0.01 mL弃去。这里的“约”来自瓶壁残液，若要精确按活细胞数接种，用实际测得浓度计算并相应调整培养基补液量；不要伪装成体积绝对守恒的精准计量。
06时间安排
| 时间 | 操作 |
|---|---|
| 0–15 分钟 | 预温工作液、写标签、显微拍照 |
| 15–20 分钟 | 吸旧液、5 mL PBS清洗、加2 mL胰酶 |
| 随后5–15分钟 | 每1–2分钟看一次脱落终点，不固定等满15分钟 |
| 脱落后约10分钟 | 终止、计数、分三瓶、回箱 |
| 18–24小时 | 检查三瓶贴壁、形态和分布 |
07开始前的准备
- 核对细胞名、当前代次和最近检测结果。倒置镜观察5个区域，记录汇合度；若已明显过密、大片死亡或疑似污染，不作为标准教学起始样本。
- 完全培养基、PBS和胰酶仅取所需工作量，按试剂保存与预温要求处理，不反复预温整个原液瓶。
- 新瓶标注细胞名、日期、操作者、新代次。三瓶分别预加11.67 mL完全培养基，在37°C、5%CO₂中平衡，等待接种。
- 将计时器和显微镜放在可立即使用位置；开始解离后不能再离开找耗材。
左、右为CHO-K1的低密度与高密度示例，用于学习观察细胞间空隙及密度变化。细胞株不是本教程HeLa，不能当作本篇培养结果或据图套用传代阈值。来源为ATCC技术指南，非商业推广。
原图为HeLa的低密度（左）和高密度（右）形态，保留两面板及100 μm标尺。仅去除顶部目录编号栏；此为来源机构参考图，不是本篇实验结果，不能按其图像密度直接设定传代或衰老阈值。
08逐步操作
- 在柜内取出原瓶，稍倾斜，吸去旧培养液。吸头放液体聚集的一角，不刮擦细胞层。
- 沿壁加入5 mL无钙镁D-PBS，轻轻前后左右晃一次，使其覆盖底面；随即吸净。不要让细胞层变干，也不要留下明显PBS液池稀释胰酶。
- 加2 mL指定Trypsin-EDTA，缓慢倾斜使整个底面湿润，立即开始计时。先在室温下观察；如脱落较慢，可按ATCC该株说明放到37°C促进解离，每1–2分钟取出检查。
- 在倒置镜下观察：细胞逐渐圆缩、相互连接减少，轻轻倾斜瓶子时多数细胞能随液体移动，就是终点。ATCC典型窗口5–15分钟，但一旦已脱落即进入下一步，不为凑时间继续消化；等待期间不猛拍或摇晃培养瓶。
- 立即加入8 mL完全培养基终止；用10 mL移液管轻柔吸打约3–5次，沿底面缓慢冲洗残留细胞。观察悬液无明显大片细胞片后停止，不持续打出泡沫。
- 将约10 mL悬液转至15 mL无菌管，轻柔混匀。立即取20 µL进入独立计数管；按计数教程测活细胞浓度和活率。染色液不得回到培养体系。
- 向收获管补20 µL完全培养基补偿取样体积，再轻柔混匀。记录浓度经此次补液略降，正式计量可按补液后体积修正；若测得原悬液1.0×10⁶个活细胞/mL，单瓶接种约3.32×10⁶个活细胞，而非宣称精确3.33×10⁶。
- 每给一瓶分装前轻柔重悬一次，以免后分的瓶细胞更密。分别向三瓶预加11.67 mL培养基的T75加入3.33 mL细胞悬液，每瓶最终15 mL。
- 盖好瓶盖，前后轻移2次、左右轻移2次，不做大幅圆周旋转。立即放入37°C、5%CO₂培养箱，透气盖保持正常工作状态。
- 记录实际解离温度、开始和终止时间、活率、三瓶体积及接种数。18–24小时复查，拍摄每瓶相同位置类型的图像，之后按密度安排每周2–3次换液或再次传代。
09结果判断与质控
次日三瓶应有较均匀贴壁细胞，形态接近传代前，培养基澄清。教学质控可预设活率≥90%且无大片漂浮细胞作为继续扩增目标；该阈值为本室待验证的教学标准，不是ATCC对所有批次的承诺。单纯“按1:3分瓶成功”不能代替计数、活率和后续增长记录。
10实验记录模板
| 日期/操作者 | 来源瓶/代次 | 汇合度 | PBS量 | 胰酶批号/量 | 解离温度/分钟 | 终止液量 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| 新瓶编号 | 新代次 | 活细胞浓度 | 活率 | 悬液量/补液量 | 最终体积/接种数 | 次日图片/状态 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
11常见问题与排错
- 15分钟仍未脱落：检查PBS是否吸净、胰酶保存和失效情况、细胞是否过度融合。不要无限延时或猛拍；记录失败并与熟练人员核查试剂后重新安排。
- 团块很多：终止后轻柔重悬；若仍有大片团块，计数结果代表性不足，标记本次异常，不用大力吹打把损伤隐藏成单细胞。
- 三瓶密度不一致：检查分装前是否沉降，是否圆周摇动把细胞聚到中央；下次每瓶前先混匀并按前后左右平移。
- 次日大量漂浮：回看真实消化时长、活率和旧瓶状态；检查培养箱。发生广泛损伤时先恢复培养和查因，不立即做药效实验。
12参考资料
- ATCC：HeLa CCL-2，T75专属传代程序：已核对2–3 mL解离液、通常5–15分钟、6–8 mL完全培养基、1:2–1:6。
- ATCC：Animal Cell Culture Guide，细胞计数与单层传代章节。
- PBS 5 mL、每瓶15 mL以及1:3分装计算为本页教学设置；未把它们声称为全部细胞株的标准。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。