01本篇适用条件
本例仅用于 ATCC HeLa CCL-2、未人为追加感染且未作额外危险修饰的常规培养，使用 ATCC 配方 EMEM（30-2003）与 FBS（30-2020），37°C、5% CO₂。该株不是 HeLa S3，不能把本例培养基照搬到其他株、原代或干细胞。ATCC 将 CCL-2 列为 BSL-2，并注明含 HPV 序列；“常规细胞系”不代表可在开放台面处理。操作者应已完成机构相应培训，并在经检定的Ⅱ级生物安全柜内工作。
本页的 100 mL 配液量、T25 中 5 mL 培养体积以及柜内练习顺序是教学设置。正式操作前确认这些设置适合本室容器和已验证流程。首次练习先用无菌水模拟开盖、吸液和换头，再接触细胞。
02实验原理
本次要完成两个可检查的产物：一瓶配方和批号完整的完全培养基，以及一瓶换液后仍均匀贴壁的细胞。无菌操作的重点是保护每次打开的瓶口和液体路径；酒精不能弥补枪头碰到瓶沿、吸管越过废物或同时打开多株细胞造成的风险。
03安全与适用范围
HeLa CCL-2 按 ATCC BSL-2 和本机构风险评估执行。使用经检定的Ⅱ级生物安全柜，避免气溶胶和开放吸液；废物采用机构批准的失活程序。70%乙醇易燃，柜内无明火。
04材料与仪器
- 已通过入库身份确认、支原体检测的 HeLa CCL-2 一瓶 T25，细胞未过密；倒置显微镜。
- 上表培养基原料；无菌 125 mL 或更大带盖配液瓶；2、5、10、25 mL 无菌血清移液管和电动吸液器。
- Ⅱ级生物安全柜、37°C/5% CO₂ 培养箱、37°C 水浴或干式预温设备。
- 实验服、手套、机构认可的 70% 乙醇与其他适用消毒剂；带防倒吸和疏水过滤装置的封闭废液系统。
- 计时器、耐水标签和下方记录表。消毒剂接触时间取本室批准产品的标签值，开始前把该数值写入记录；不凭“喷完就算消毒”判断。
05配液与用量
| 配制对象 | 组分 | 实际加入量 | 配成后结果 |
|---|---|---|---|
| HeLa 完全培养基，100 mL | EMEM，ATCC 30-2003，现成 1× | 90 mL | 不再额外补粉剂或碳酸氢钠 |
| 同一瓶 | FBS，ATCC 30-2020 | 10 mL | 总量 100 mL，FBS 终浓度 10% v/v |
| 一次 T25 换液 | 上述完全培养基 | 5 mL | 换掉旧液后的最终培养体积 5 mL |
90+10=100 mL；不能在 100 mL 基础培养基里直接加 10 mL FBS 后称为 10%。本例不加抗生素。FBS 是否热灭活不能自行决定，本配方不增加热灭活步骤。培养基标签写名称、FBS 比例、两种原液批号、配制日、配制人和本室规定的有效期；保存条件采用各原液说明和本室验证期限，不在本页虚设一个通用保质期。
06时间安排
| 相对时间 | 要做什么 | 结束标准 |
|---|---|---|
| 0–10 分钟 | 核对细胞和柜体；启动运行并按设备验证时间等待 | 无报警，气流稳定 |
| 10–25 分钟 | 擦拭、摆台、配 100 mL 培养基 | 标签完整、液体澄清 |
| 25–40 分钟 | 分取 5 mL 培养基，37°C 预温约 15 分钟 | 工作液接近培养温度，不反复加热母瓶 |
| 40–50 分钟 | 显微检查、换液、放回培养箱 | 细胞层未被吸干或冲掉 |
| 次日同一时段 | 检查形态和培养基 | 留有图像和异常记录 |
07开始前的准备
- 核对冻存来源或传代记录、细胞名、代次、支原体检测日期。未完成准入检测的新细胞留在隔离流程中。
- 查看培养箱实际显示及独立核查记录：37°C、5% CO₂，水盘与清洁状态合格。观察原瓶并拍照；若已有浑浊、菌丝或异常颗粒，停止本次换液并隔离。
- 在柜外写好配液瓶和 T25 标签。核对每支移液管包装完好，放入柜内的物品只取本次需要量。
- 擦净柜内表面后按所用消毒剂接触时间保持湿润；开工前运行时间采用该柜设备规程，记录实际分钟数。柜内不使用明火，也不以紫外线代替擦拭。
左为未污染、右为污染培养物的Hoechst染色，保留两幅原始面板。此为来源指南的污染观察示例，未指明是HeLa；日常明场观察正常不能排除支原体，也不能仅凭此图确诊自己的培养物。
上下分别为KU812E与MRC-5，完整保留两组位点及等位基因峰，用于理解细胞身份核验。不是本篇HeLa的STR谱，也不是待测样本鉴定结果；需与该细胞株的参考谱逐位点比较。
08逐步操作
- 将经表面消毒的未开封耗材、原液和配液瓶放入柜内。清洁用品放一侧，操作区在中央，废物放另一侧；前后格栅保持通畅，手臂不压住前进风口。
- 戴手套并按设施流程处理手套表面。开 1 支无菌 25 mL 移液管，吸取 EMEM 25 mL，加入配液瓶；继续以无菌方式加入 25、25、15 mL EMEM，累计 90 mL。取液时瓶口不接触吸管外壁，移液管尖不触台面。
- 更换无菌 10 mL 移液管，加入 10 mL FBS。立即盖紧两种原液和配液瓶，轻柔倒转混匀 5 次，避免起泡；检查总量计算为 100 mL 并完成标签。
- 另取无菌带盖工作管，用新移液管分出 5 mL 完全培养基。母瓶及时放回符合标签要求的冷藏条件，工作管在 37°C 预温约 15 分钟。液体达到温度即取出，瓶盖接口不浸水。
- 显微镜低倍观察 T25 的 3–5 个位置，记录汇合度、形态和是否出现可疑污染。仅在无需传代且细胞层状态合格时继续；若已约 80% 汇合并需扩增，转到传代教程。
- 将 T25 外表面消毒后放入柜内，轻微倾斜使旧液聚到远离细胞层的一角。用无菌吸管吸去旧液，吸头不触细胞层；立即进入下一步，不能让表面风干。
- 沿瓶壁缓慢加入预温完全培养基 5 mL。此次常规换液不加 PBS、不加胰酶。前后、左右各轻移 2 次，让液体覆盖细胞层，勿使液体冲向一个点。
- 盖好培养瓶，透气盖按容器设计置于工作状态。放回 37°C、5% CO₂ 培养箱，记录实际换液时间、加入量和代次；单纯换液不增加传代数。
- 原液全部盖好后再清理废物。按机构程序处理液体和固体废弃物，用适用消毒剂擦拭柜面并达到规定接触时间，填写设备使用记录。
- 次日观察同瓶相似区域并拍照。之后以 ATCC 推荐每周换液 2–3 次为起点，结合密度安排；记录实际日期，不把“培养基变黄后再换”当固定规则。
09结果判断与质控
配液后应澄清、无沉淀或标签缺失；换液后细胞层保持贴壁，次日形态与换液前相近。培养基偏黄也可能是细胞过密或 CO₂/pH 问题；外观正常不能排除支原体。发现污染时隔离并报告，不靠补抗生素维持该瓶。
左、右为CHO-K1的低密度与高密度示例，用于学习观察细胞间空隙及密度变化。细胞株不是本教程HeLa，不能当作本篇培养结果或据图套用传代阈值。来源为ATCC技术指南，非商业推广。
原图为HeLa的低密度（左）和高密度（右）形态，保留两面板及100 μm标尺。仅去除顶部目录编号栏；此为来源机构参考图，不是本篇实验结果，不能按其图像密度直接设定传代或衰老阈值。
10实验记录模板
| 日期/操作者 | 细胞/代次 | EMEM批号 | FBS批号 | 90+10 mL核对 | 柜号/运行分钟 | 消毒剂/接触时间 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| T25编号 | 换前汇合度 | 旧液状态 | 新液体积 | 培养箱/实际温度CO₂ | 次日形态/图片号 | 偏差与处置 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
11常见问题与排错
- 枪头碰到瓶口外沿或台面：丢弃该枪头；若已将其伸入原液，立即标记该分装为疑似污染并隔离，不倒回母瓶。
- 加入培养基后细胞成片漂浮：复核吸液尖是否刮过细胞层、细胞是否干过、液流是否太急，保留原图；下次从瓶角吸液并沿壁缓慢加入。
- 新配培养基颜色异常：先检查是否错用培养基、CO₂ 平衡与温度，再查污染。不能根据颜色一项决定可用。
- 同一柜还要做另一株：先收走当前细胞和开封工作液，完成分批清理消毒后再开始，不能同时敞开两株细胞瓶。
12参考资料
- ATCC：HeLa CCL-2，完整培养基、培养条件、BSL-2 与换液频次，已阅读产品页。
- ATCC：Animal Cell Culture Guide，无菌操作、污染检查与培养基管理，已阅读指南相关章节。
- 100 mL 配液批量、5 mL/T25 与约15分钟预温为本页教学操作设置，需在本室确认；不是细胞库宣称的所有培养容器通用量。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。