01本篇适用条件
仅对商业纯化λ DNA/HindIII片段标准进行体外连接示范，不使用感染性噬菌体颗粒、不培养宿主、不设计或筛选外源载荷。固定使用Promega普通T4 DNA Ligase，瓶签活性恰为1 Weiss U/μL，配套10×含ATP连接缓冲液。设置待测标准片段S、独立已知合格标准片段P、S无连接酶U和无DNA有酶N；电泳仅评价片段是否出现酶依赖的迁移变化。
02实验原理
T4 DNA连接酶在5′磷酸与3′羟基之间形成磷酸二酯键，需要Mg²⁺、ATP及合适末端。本商业HindIII片段有可相容黏端和5′磷酸，可形成更大分子或不同构象。Weiss单位与其他厂商的cohesive-end单位定义不同，不能用同一个“U”数字跨产品换算。
完整保留两段DNA、黏端、连接箭头及产物。原图以EcoRI的AATT突出端示范相容末端，本文商业λ/HindIII标准的突出端不同，不能从本图确定本文末端序列、连接方向或产物结构；本篇仅作体外连接活性示范。
03安全与适用范围
戴手套、实验服和护目镜，保持商业标准DNA和试剂来源清楚。酶液冰上操作，缓冲液含DTT需按SDS处理。电泳和染料按既有教程执行；本篇完成于体外反应和胶分析，不进行转化或活体扩增。
04材料与仪器
- Promega普通T4 DNA Ligase，实际标签1 Weiss U/μL；其10×Buffer含300 mM Tris-HCl pH7.8、100 mM MgCl₂、100 mM DTT、10 mM ATP。
- 商业λ DNA/HindIII片段标准两份独立已确认批次，均20 ng/μL；不是含染料的ready-to-load混合物，未去磷酸化。
- 无核酸酶水、4支低吸附管、冰盒、22°C可控孵育器、计时器、移液器；琼脂糖分析胶和适合大范围片段的DNA ladder。
05配液与用量
| 组分 | S待测 μL | P已知标准 μL | U无酶 μL | N无DNA μL |
|---|---|---|---|---|
| 水 | 3 | 3 | 4 | 8 |
| 配套10×连接Buffer | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对应20 ng/μL片段标准 | 5 | 5 | 5 | 0 |
| T4 DNA Ligase 1 Weiss U/μL | 1 | 1 | 0 | 1 |
| 总量 | 10 | 10 | 10 | 10 |
每含DNA管100 ng，反应中Buffer1×，ATP1 mM、MgCl₂10 mM、DTT10 mM。酶瓶若不是1 Weiss U/μL，不能照抄此表，也不擅自用水稀释酶。分析时各取完整10 μL，加6×上样液2 μL，总12 μL。
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 解冻Buffer与配液 | 冰上配反应 | 15–20分钟 |
| 连接 | 22°C | 3小时 |
| 终止 | 70°C | 10分钟 |
| 电泳及成像 | 依分析胶设置 | 约1–2小时 |
07开始前的准备
查本批酶的实际Weiss单位，匹配普通规格；高浓度酶不可直接同体积替代。缓冲液须完全解冻并溶清，ATP反复冻融会失效，优先用小份新鲜冻存液。确认标准DNA为纯化片段而不是已经混了loading dye的marker；两份标准物料的切割模式可比。泳道图包括独立长度ladder、U、P、S、N；胶孔容量至少15 μL。
利用箭头辨认电极、胶槽与制胶组件，再按正文核对上样孔朝负极以及DNA迁移方向。图中设备仅为结构示例，不能照搬电源旋钮、尺寸或电压。来源为Addgene技术教程局部图，非商业推广。
08逐步操作
- 标四管S、P、U、N，分别记片段批次、酶活性和buffer冻融次数，按表核算每管10 μL。
- 完全解冻10×Buffer，若见冻存析出按说明混匀至复溶，再短暂离心；酶本身留冰上，不涡旋酶。
- 各管先加3、3、4、8 μL无核酸酶水，分别打勾；小体积使用量程合适移液器。
- 每管加1 μL配套10×含ATP Buffer，轻吹打混匀，N也含同样buffer。
- S/U各加5 μL待测标准片段，P加5 μL已知合格标准，N不加DNA；每个来源换头。
- 最后给S、P、N各加1 μL T4 DNA Ligase，共1 Weiss U，U不加酶，酶取用后立即返回冰盒。
- 轻吹打5次使反应混匀，短暂离心收液，不留液滴在管盖；检查总体积10 μL且无明显气泡。
- 四管同时放22°C孵育3小时，记录起止时间，实际温度偏离应记录而非只写“室温”。
- 按该Promega普通连接酶官方条件，将四管均70°C处理10分钟后置冰，保持对照处理一致。
- 各管加入2 μL 6×上样液，轻混，总量12 μL；准备匹配DNA ladder，确保孔容量足够。
- 按泳道图将每管完整12 μL上样，进行琼脂糖分析；大分子可能靠近孔口，保留孔及完整胶范围。
观察枪头与胶孔的位置；正文上样时避免戳破胶底、漏到缓冲液或挤入相邻孔。照片是原教程示例，不代表本篇样本、上样量或实验结果。来源为Addgene技术教程，非商业推广。
Addgene Agarose Gel Electrophoresis：Loading gel imageAddgene版权技术教程局部摘录，未据此声明开放许可；非商业推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗
Addgene原教程第三幅照片：观察运行进度；不凭照片估计DNA片段长度。开盖、触碰胶槽或调整接线前必须先停电并断开电源。
- 保存未裁切全胶和曝光，先确认U显示商业片段图谱，P相对U出现更高分子迁移改变，N无DNA带。
- 比较S与P/U，记录酶依赖的图谱变化；仅见孔口信号不能证明预期单一连接物，严重滞留还可能为聚集。
- 报告“连接活性示范”的范围与未确定结构，清理废液和凝胶；如未来有特定结构研究，另行设计独立结构验证，不从本胶直接宣布构建成功。
09结果判断与质控
P和活性正常的S应较U出现高分子或不同构象信号，部分原片段减少；N无DNA。非变性琼脂糖胶可能受非共价黏端退火影响，因此需要相同热处理无酶对照，结果仍只是体外连接活性的支持证据。不能据胶图推断序列、连接方向、环化比例或获得正确克隆。
10实验记录模板
| 管/标准批次 | DNA ng及μL | 酶Weiss U/μL及μL | Buffer批次/冻融 | 22°C起止 | 70°C起止 | 电泳泳道/原图 | 判定及局限 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| S/P/U/N | 100/5或0 | 1/1或0 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
S和P都无变化
查酶标签单位、ATP-buffer冻融、末端是否相容及是否误用ready-to-load染料混合物；使用新鲜配套buffer验证。
N有DNA带
查标准或样本交叉污染及上样溢出，换清洁耗材重做，不把阴性条带解释为连接产物。
所有DNA停在孔口
查高盐、聚集、DNA过量和胶浓度，先改善分析条件，不能只凭滞留宣布高连接效率。
12参考资料
- 用户提供《分子生物学实验手册 来源网络仅供参考》PDF物理第51页：T4连接、配套buffer与温度的历史线索；不沿用其不同厂家单位混写及未经验证的成功率。
- Promega，T4 DNA Ligase, Blue/White Cloning Qualified Protocol，修订2018-04，物理第1–2页；T4 DNA Ligase技术规格，查阅日期2026-11-02：核对Weiss单位、10×Buffer组成、0.1–1 Weiss U/10 μL、黏端22°C 3小时及70°C 10分钟灭活。本例商业标准片段和四管质控为教学设置。
- Addgene，DNA Ligation，查阅日期2026-11-02：核对ATP冻融影响及无酶/无DNA等对照的用途；本例不开展载荷设计、转化或宿主培养。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。