SA-β-gal 衰老染色：IMR-90、pH6.0与无CO₂显色

02实验原理

活培养阶段在5%CO₂中，染色显色阶段必须转到37°C无CO₂干式培养条件，避免pH下降导致假阳性。准备健康低群体倍增参照与已预验证阳性参照；细胞过密、长时间饥饿和损伤也可影响结果。记录累计群体倍增数比仅写“P几代”更能说明IMR-90状态。

04材料与仪器

IMR-90低倍增健康细胞和阳性参照；CST9860整套、DMSO、PBS、纯水；六孔板；独立无CO₂37°C干式孵育设备；pH计或适配微量pH检查工具、密封膜、200×总放大明场镜。

05配液与用量

显色液930+10+10+50=1000µL。按本批缓冲液检查最终pH，不能因含X-gal就默认合格；必要调整须在无细胞工作液中进行，并重新测pH。

06时间安排

07开始前的准备

六孔板候选每孔5×10⁴活细胞/2mL起始，保证终点未长期过密。若尚无阳性材料，可先做100与200µM H₂O₂各2小时、恢复5天的预试，收集死亡和增长记录；这只建立候选模型，不保证诱导衰老。阳性判定仍需结合EdU下降、持续停滞等证据。正式对照与候选同日起始、同密度，避免把不同密度造成的背景当衰老。

08逐步操作

1. 核对IMR-90来源、累计倍增数和污染检测，健康单细胞以5×10⁴/2mL铺六孔板，37°C/5%CO₂贴壁。
2. 若采用应激候选，去旧液后加2mL200µM H₂O₂完全培养液；参照孔换2mL同批无H₂O₂培养液，37°C处理2小时。
3. 终点去处理液，用2mL PBS轻洗一次，换2mL新鲜完全培养基，恢复5天，第2、4天各温和换液2mL。
4. 第5天记录形态、密度与细胞损失；若大面积死亡或已长期过密，不把此样本当已建立衰老阳性，重新优化预试。
5. 染色时吸去培养液，用2mL1×PBS洗一次，沿壁吸走，不能让细胞层风干。
6. 每孔加1mL套装1×固定液，室温15分钟，落在厂家10–15分钟范围内；不延长到数小时。
7. 去固定液，以2mL PBS温和洗2次；若无法马上染，可依套装允许条件PBS覆盖4°C过夜，所有组一致记录。
8. 按表现配1mL显色液，确认最终pH5.9–6.1，每孔加1mL完全覆盖细胞。
9. 封好板防蒸发，在37°C无CO₂干式孵育设备中放过夜，本例约16小时；不能放回平常5%CO₂培养箱显色。
10. 仍有显色液覆盖时用约200×总放大观察蓝色胞质，固定相机白平衡和曝光，拍每孔5个预设非重叠视野。
11. 逐个计完整细胞及明确蓝色细胞，目标每孔至少300个；沉淀颗粒、碎片和过深蓝难分团块标记，不随意设为阳性。
12. SA-β-gal阳性率=蓝色细胞数÷完整细胞总数×100%。同时记录EdU或独立增长信息；需保存时按套装建议用70%甘油覆盖、4°C保存并写明时间。

09结果判断与质控

300个完整细胞中90个呈明确蓝色，阳性率30%。若低倍增参照也普遍深蓝，应先查pH、过密和显色条件。结论应写SA-β-gal阳性比例增加；没有多指标及持续停滞证据时，不写“已证明细胞衰老”。

10实验记录模板

11常见问题与排错

蓝色太多：查是否误用CO₂箱、pH偏低、样本过密。全不显色：查X-gal溶解与保存、过度固定、pH偏高和阳性参照。晶体多：查蒸发密封和工作液沉淀，不把晶体当阳性细胞。

12参考资料

• CST：#9860官方产品与操作手册，已读取930/10/10/50µL配方、X-gal20mg/mL、pH6.0、室温10–15分钟固定及37°C无CO₂过夜。
• ATCC：IMR-90 CCL-186，已读取有限倍增性质、EMEM+10%FBS、37°C/5%CO₂与BSL-1。
• H₂O₂候选、起始细胞数、恢复5天及16小时观察点为本页教学预试，不是厂家已认证的衰老诱导方案。