01本篇适用条件
使用1 mm厚、10孔、每孔容量≥30 μL的10% Tris-glycine预制胶及兼容小型竖直电泳槽，样本为非感染性NIH/3T3澄清RIPA蛋白，已BCA定量。每孔20 μg、总20 μL。此胶适合普通中等分子量蛋白示范，不保证极小、极大或易聚集蛋白分辨；不得替换成Bis-Tris胶后仍沿用Tris-glycine跑胶液。
02实验原理
SDS和还原处理使多数蛋白主要按相对分子质量迁移。预染Marker用于估算大小，考马斯总蛋白谱用于观察上样和分离；它不能单独鉴定某条带的蛋白身份。
03安全与适用范围
戴手套、实验服和护目镜。胶虽已聚合仍按实验化学废物管理；本教程不处理丙烯酰胺单体。通电前盖好设备，断电拔线后才能接触缓冲液和拆胶。含甲醇染液另按SDS处理。
04材料与仪器
- 匹配Tris-glycine预制胶及竖直槽、完整电缆和电源、预染蛋白Marker。
- 已定量2 μg/μL的RIPA裂解物、同RIPA、DTT、Tris、SDS、甘油、溴酚蓝。
- 即用型水基考马斯G-250染液（如SimplyBlue SafeStain LC6060），去离子水、摇床、耐热加热块、成像装置。
05配液与用量
| 液体 | 配方 | 终浓度/用量 |
|---|---|---|
| 1×跑胶液1 L | Tris base3.03 g、glycine14.4 g、SDS1 g、水至1 L | 25 mM/192 mM/0.1%，不调pH |
| 2×上样液1 mL | 1 M Tris pH6.8 125 μL、20%SDS200 μL、甘油200 μL、1%溴酚蓝20 μL、1 M DTT100 μL、水355 μL | 125 mM Tris、4%SDS、20%甘油、100 mM DTT |
| 每孔样品20 μL | 2 μg/μL蛋白10 μL+2×上样液10 μL | 20 μg；DTT50 mM，含0.1%SDS的RIPA带入后总SDS约2.05% |
| 半量对照 | 蛋白5 μL+RIPA5 μL+2×上样液10 μL | 10 μg，同为20 μL |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 变性 | 95°C | 5分钟 |
| 电泳 | 本例兼容小胶100 V恒压 | 60–90分钟，以染料位置终止 |
| 水洗 | 每次100 mL水 | 3×5分钟 |
| 染色/脱背景 | 20 mL即用染液；水洗 | 1小时/至少1小时，按成像需要延长 |
07开始前的准备
画泳道图，至少包含Marker、10 μg和20 μg同源蛋白、两份待测样本及空白上样液。核对孔容量、胶底封条及设备上限。若蛋白低于2 μg/μL，不能在固定20 μL中硬塞20 μg；先统一降低质量并验证，或浓缩后重新定量。以下100 V为普通兼容小胶教学设置，须低于具体装置额定值。
观察玻璃板及灌胶架相对位置；本篇采用预制胶，不按照片灌制丙烯酰胺。
该图展示原文自灌胶操作，与本篇预制胶不同；不能从照片推断配方、聚合完成或适用浓度。
08逐步操作
- 配1 L跑胶液，完全溶解后标日期，避免误拿转膜液。若SDS低温析出，温和复溶并回室温后使用。
- 按表配新鲜含DTT的2×上样液，混匀；分别标样本管与10/20 μg对照管。
- 每管按表加蛋白、必要的RIPA及10 μL上样液，轻吹打5次，总20 μL，逐项勾选。
- 盖紧，95°C加热5分钟，短暂离心收液，置室温。出现大量不溶物时先查目标性质和样本条件，不用针头强塞上样孔。
- 拆预制胶包装、去底部封条，装到兼容槽的夹架；若只有一块胶，使用该槽的匹配挡板，不拿玻璃片临时堵漏。
将灌胶或预制胶组件与完整槽体对应；图为特定型号外观，不用于推断其他设备的接线和装配方向。
《免疫学实验技术手册》第十一版，2026.8，物理PDF第14页用户提供文档，技术图局部摘录点击图片查看原图 ↗ - 缓慢拔梳，以跑胶液冲孔。上室加约200 mL、下室约600 mL，实际以本槽规定刻度为准；静置2分钟确认上室液面稳定，无漏液才继续。
观察内外槽与胶盒位置；液位和缓冲液体系按实际设备及胶说明书，不从照片推断电极方向。
Mahmood & Yang, Western blot: technique, theory, and trouble shooting, 2012，Figure 3CC BY-NC-SA 3.0；完整原图，格式转换查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - Marker使用说明书标为5 μL/泳道的即用规格，上5 μL；各样本上20 μL，新头逐孔，勿戳孔底。空白泳道加与样本相同总体积的无蛋白上样混合液。
观察枪头与上样孔的位置关系；照片不能确认载量、破孔、交叉污染或操作人员所用参数。
Mahmood & Yang, Western blot: technique, theory, and trouble shooting, 2012，Figure 4CC BY-NC-SA 3.0；完整原图，格式转换查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 盖槽接线，黑负红正，100 V恒压运行。启动后确认有小气泡且示踪液向胶底移动，5分钟检查一次方向和液面。
辨认上样孔及从负极到正极的蛋白迁移方向；原图同时说明部分小蛋白可能跑出胶外。图内100–150 V仅为原设备示例，实际条件按本篇预制胶与设备SOP。
《免疫学实验技术手册》第十一版，2026.8，物理PDF第13页用户提供文档，技术图局部摘录点击图片查看原图 ↗ - 之后每15分钟查看，前沿距胶底约5 mm时停止，通常60–90分钟。明显发热、液面下降或电流突变立即停机检查，不坚持跑满预定时间。
保留a/b两幅，不用示踪染料前沿代替目的蛋白位置；照片不确定通用电压，原文电压描述也不能替代本机SOP。
Mahmood & Yang, Western blot: technique, theory, and trouble shooting, 2012，Figure 5CC BY-NC-SA 3.0；完整原图，格式转换查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗
原文展示其体系的终点位置；小分子蛋白可能跑出，不能把染料到胶底作为所有靶标共同终点。
Mahmood & Yang, Western blot: technique, theory, and trouble shooting, 2012，Figure 6CC BY-NC-SA 3.0；完整原图，格式转换查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 关闭并断开电源后拆胶，从边角缓慢取出，切掉无蛋白余边，放入洁净染色盒，不用镊子夹住有效泳道拉扯。
- 每次100 mL去离子水，室温轻摇洗5分钟，换水重复3次，降低SDS背景；薄胶应完整平铺，不能折叠黏住。
- 加20 mL即用SimplyBlue染液，室温轻摇1小时，染液覆盖整胶；然后倒出染液，以100 mL水轻摇脱背景至少1小时，背景仍高可继续换水。
- 与Marker共同采集完整胶图，不裁掉空白及低量对照。检查10和20 μg泳道总体信号随上样增加、条带分离且无明显弯曲，再保存泳道编号和运行数据。
09结果判断与质控
应见分离的蛋白谱及清楚Marker，不同上样量大致呈强度递增。考马斯染色有检测下限和非线性，不能仅凭某条带深浅计算目标表达倍数；识别目标需要抗体、质谱或其他证据。跑出胶底的小蛋白不会因延长染色恢复。
该段全部示例完整保留，包括原文二维胶中的银染杂点例，并非全部为考马斯染色结果；用于比较污染、上样量与染色异常外观，不把二维凝胶前处理套入本篇一维预制胶，也不据单个外观确定原因。
保留旧59页47同类诊断图在网络汇编中的完整纵向视野；上、下两panel展示凝胶表面及聚合不均现象。旧59文档缩短了图像视野，本图补足完整胶图；不推荐照抄旧文处理配方。
保留SDS结合不足、过载双panel及染色杂点原图的完整纵向视野；包含银染杂点，是二维电泳背景的诊断例，并非全部为考马斯染色，不作为本篇一维预制胶的结果或唯一归因证据。与旧59页47较窄的图像互相核对，未删减原panel。
10实验记录模板
| 胶批次/体系 | 泳道/样本 | 原浓度μg/μL | 上样μg/μL体积 | 电压/运行min | 染色时间 | 全胶图 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
泳道笑脸或弯曲
检查发热、盐过高及缓冲液误配，降低电场并验证；不要靠拉伸图像矫正。
整条拖尾
查过载、蛋白降解和裂解不完全，减少上样量或重提。
胶完全无蛋白而Marker正常
检查BCA计算、加样是否漏孔和染液有效性，保存失败图。
12参考资料
- Mahmood & Yang，Western blot基础方法与排错：参考样品与分离原理，不直接套用其所有电压表述。
- SimplyBlue SafeStain LC6060：水基即用染液；本篇染色规模和100 V运行是明确教学设置，使用前核对实际预制胶及设备兼容性。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。