01本篇适用条件
普通非感染性培养细胞的完整总RNA10 μg/反应；使用已纯化、长度304 nt的生物素标记反义β-actin RNA探针，已知互补保护区245 nt。使用RPA III的Hybridization III、Digestion III和Inactivation/Precipitation III固定体系；电泳后采用BrightStar BioDetect，不与DIG抗体检测混用。不含放射标记制备。
02实验原理
过量反义探针与靶RNA形成双链，RNase A/T1消化单链，保护片段经变性PAGE按长度分辨。未消化完整探针是304 nt而目标245 nt，二者不同有助于判断消化；只有匹配阳性与消化对照成立才能把保护信号解释为靶RNA。
原Figure 1完整保留总RNA、反义探针、共沉淀、变性杂交、RNase消化、同时沉淀及保护片段分离。图中的labeled probe涵盖原体系标记，本文非放射检测须按相应探针及显色步骤执行；此RPA不是重组酶聚合酶扩增。
03安全与适用范围
RNase A/T1与丙烯酰胺试剂防皮肤/吸入暴露；优先使用预制尿素胶。若现场配胶，未聚合丙烯酰胺须在指导者带教下于指定通风区处理并独立收废；尿素胶、电泳与转膜设备断电后开盖。全程无放射性试剂。
04材料与仪器
- 总RNA、已知阳性普通细胞RNA、与该探针无互补性的酵母RNA阴性、300 pg/μL生物素反义探针、三种RPA III缓冲体系、配套RNase A/T1及Loading Buffer II。
- 预制/经验证5%丙烯酰胺8 M尿素13×15 cm变性胶、0.5×TBE、正电尼龙膜、半干转膜仪、80°C烘箱、BrightStar BioDetect洗液/封闭液/Assay Buffer、Streptavidin-AP及即用CDP-Star；无RNase耗材、冷冻离心机与化学发光仪。
05配液与用量
| 项目 | 本例配制/用量 | 核对点 |
|---|---|---|
| 每管15 μL杂交 | 10 μg RNA以水补至4 μL+300 pg探针1 μL+Hybridization III10 μL | 样本S、阳性P、酵母Y+与Y−各一管 |
| RNase消化液，3管用量留余量 | RNase A/T1 5 μL+Digestion III495 μL | 1:100，现配；每管150 μL，Y−只加无酶缓冲液 |
| 终止/沉淀 | 每165 μL消化物加225 μL Inactivation/Precipitation III | 共390 μL；不另加未经核实的盐 |
| 5×Wash配1×150 mL | 5×Wash30 mL+水120 mL | 25 cm²检测膜洗涤合需125 mL，留25 mL余量 |
| 10×Assay配1×25 mL | 10×Assay2.5 mL+水22.5 mL | 检测前两次各12.5 mL |
| Streptavidin-AP10 mL | 原液1 μL+即用1×封闭液9.999 mL | 1:10000；仅供完整浸没5×5 cm膜 |
| CDP-Star | 即用液1.25 mL/25 cm² | 不再稀释；与Southern所用浓缩底物分开标识 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 预计时间 |
|---|---|---|
| 杂交 | 95°C3–4分钟；42°C | 过夜12–16小时 |
| 消化/沉淀 | 37°C30分钟；−20°C15分钟；4°C离心 | 约1小时 |
| 电泳/转膜 | 5%尿素胶；200 mA转膜 | 约2–3小时 |
| 检测 | 室温封闭/洗涤；化学发光 | 约2–4小时 |
07开始前的准备
先画S、P、Y+RNase、Y−RNase与生物素RNA长度标记泳道；确认Y−不是无探针。304/245 nt示例必须与实际探针图谱相符，不能套在另一段β-actin探针上。准备全尺寸转膜；转后切出含全部目标泳道的约5×5 cm区域进行检测，不能把200 mA直接套到裁小膜面积。
08逐步操作
- 检查RNA完整性与浓度，分别取S/P各10 μg，Y+/Y−各10 μg无互补酵母RNA，以水补各管至4 μL。
- 各管加1 μL300 pg/μL生物素探针及10 μL Hybridization III，混匀短暂离心，最终15 μL。
- 95°C加热3–4分钟使RNA解链，立刻置42°C恒温设备，杂交12–16小时，密封防蒸发。
- 按表将RNase A/T1以Digestion III稀释1:100；另取不含RNase的Digestion III供Y−。
- 向S、P、Y+各加150 μL稀释RNase，Y−加150 μL无酶缓冲液，混匀后37°C30分钟。
- 每管加225 μL Inactivation/Precipitation III，混匀，−20°C15分钟，再4°C、至少10000×g离心15分钟。
- 小心完全吸掉液体，保留沉淀；不真空烘干、不额外进行未规定的乙醇洗涤；以8 μL Loading Buffer II重悬。
- 样品95°C3分钟；S/P/Y+各上8 μL，Y−只上1.6 μL即20%，同时上生物素RNA长度标记。
- 以经装置验证的25 mA运行13×15 cm、5%8 M尿素胶，记录电压与温度；染料到距下缘约1 cm时停止。
- 在0.5×TBE中按阴极—胶—正电尼龙膜—阳极方向装半干转膜夹层，排净气泡，200 mA转1小时。
- 标记膜方向及泳道，80°C烘15分钟固定；裁保留全样本泳道的5×5 cm检测区，其余膜标记保存。
- 室温轻摇，用1×Wash25 mL洗两次各5分钟；即用1×封闭液12.5 mL两次各5分钟，再25 mL封闭30分钟。
- 加10 mL1:10000 Streptavidin-AP室温30分钟；换12.5 mL封闭液10分钟。
- 1×Wash25 mL洗三次各5分钟，再1×Assay12.5 mL洗两次各2分钟，始终覆盖膜。
- 核酸面加即用CDP-Star1.25 mL，室温5分钟；去多余液但不让膜干，以塑料膜包好后分档成像，记录加底物至曝光的时间。
- 比较P的245 nt保护带、Y+无保护和Y−304 nt完整探针；保留短曝光与较晚2–4小时图，不把饱和曝光用于定量。
- 以同批次标准或经验证的内参和线性信号比较样本；登记所有长度、对照及失败原因，剩余RNA分装−80°C。
09结果判断与质控
有效批次为P出现245 nt带、Y+无245 nt带、Y−主要304 nt带；P失败或Y+强背景使样本不可判。保护条带长度取决于实际探针互补区，条带强度受消化、回收和曝光影响；未验证线性范围不宣称绝对定量。
原Figure 2保留全部泳道和上方编号。该历史图为原手册的RNase优化示例，样本、探针及RNase条件须按原表1对应；本文采用非放射检测，不能将原图曝光强度、特定条带或优化条件直接当作本站结果。
原Figure 1完整保留1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg生物素DNA点样梯度。此为直接点膜的试剂检测限示例，不是RNA经杂交、RNase消化、PAGE和转膜后的全流程检出限；不得将其直接写成本篇RPA灵敏度。
10实验记录模板
| 样本/完整性 | 输入μg/探针pg | 杂交时温 | RNase稀释/时温 | 胶/转膜电流 | 304/245 nt及对照 | 曝光/原图 | 解释/偏差 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。
11常见问题与排错
所有管都无带
先看Y−探针及检测阳性点，区分沉淀丢失、转膜失败和检测失败。
Y+有全长带
检查RNase活性、1:100配制和37°C；不得把未消化带认作目标。
多条保护带
核对探针纯度、可变剪接/错配及消化梯度；先验证长度与序列再解释。
12参考资料
- 旧网络手册物理第140–142页：RNase保护原理与T7模板图；旧135000×g与放射性路线未采用。
- Thermo Fisher Scientific/Ambion，RPA III Kit Protocol，Rev.B，2008-06-05，物理第9–15、41页，查阅2026-11-02：已核15 μL杂交、1:100 RNase150 μL、37°C30分钟、225 μL终止、−20°C15分钟与非放射探针检测边界。
- Thermo Fisher Scientific/Ambion，BrightStar BioDetect Kit Protocol，Rev.B，2008-10-01，物理第6–7、12–13页，查阅2026-11-02：已核半干转膜200 mA1小时、80°C15分钟、1:10000 Streptavidin-AP与即用CDP-Star。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。