蓝白筛选与重组克隆验证：8个候选的PCR、酶切和测序

02实验原理

插入破坏lacZα互补可令菌落变白，但白色也可能来自移码、缺失或其他插入；小的同框插入可仍呈蓝色。菌落PCR确定插入存在，方向PCR或酶切检查结构，最终测序确认身份和连接处。

04材料与仪器

• 适用宿主与连接转化平板、空载体阳性蓝色对照、已知插入DNA、X-gal 20 mg/mL、IPTG 100 mM、LB/Amp。
• 2×Taq PCR混合液、10 μM引物F/R、凝胶与DNA ladder；明确单切位点的限制酶及匹配缓冲液；测序条件。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先画载体图谱并列出空/重组PCR、正/反向PCR及双酶切预期长度。8候选+2蓝色+已知插入+空载体+无模板，共13管。引物退火温度须在本例Taq体系预验证；示例55°C只用于预验证通过的该引物对。

08逐步操作

1. 给转化板与空载体板分别写明宿主、抗性、X-gal/IPTG和日期；检查两板配方一致。
2. 培养16–20小时后比较显色，空载体多数应为蓝色；拍照记录原始板位。
3. 在板底圈出8个分离良好的白色菌落W1–W8及2蓝色B1/B2，避开边缘小卫星菌落。
4. 每个菌落用新枪头先在新LB/Amp主板点种保留，再将余量轻触20 μL无菌水，混匀；不挑整块琼脂。
5. 将悬液95°C处理5分钟，短暂离心；PCR只取上清1 μL。
6. 按表配15份主混合液，分19 μL于13管，再加1 μL各模板；最后加无模板水。
7. PCR设95°C3分钟；30循环95°C30秒、55°C30秒、72°C75秒；最后72°C5分钟。
8. 制1%琼脂糖胶，用同一ladder比较13管各5 μL产物；保存完整未裁剪图和板位。
9. 将约1200 bp候选标为待验证，约200 bp记空载体型；双带或杂带先重新划线，不直接宣布重组。
10. 挑2–4个独立PCR正确候选入3 mL LB/Amp，37°C培养过夜，保存对应原始主板。
11. 从同一单克隆培养物提取质粒并定量，取500 ng按图谱选定双酶切20 μL体系，37°C1小时。
12. 电泳比较未切、空载体与切样，示例应释放3 kb载体与1 kb插入；不能用未切质粒跑得快慢判断大小。
13. 将符合结构的克隆送测，至少覆盖两连接处、整段插入及功能关键区，查看原始峰图及混峰。
14. 只对序列正确且克隆来源清楚者编号保种；保存菌落板图、PCR/酶切图、序列比对及最终质粒图谱。

09结果判断与质控

有效结果需无模板无带、空载体呈200 bp型、已知插入呈1200 bp型。白色+正确条带仍不是最终身份；只有序列、方向、连接处与关键区符合设计才判正确。方向鉴定需载体侧引物加插入内部引物，不能用同一两侧引物确定方向。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

白色全是空载体

查lacZ兼容性、显色试剂与培养时间，检查小缺失造成假白。

PCR多带或测序混峰

重新划单菌落，减少菌体模板并检查引物。

酶切与PCR不一致

核对样品对应、图谱和是否消化完全；必要时全质粒测序。

12参考资料

• 旧网络手册物理第68–69页、短版第10页：重组子筛查，删除酚/氯仿粗提和“未切重组质粒应更慢”的错误判据。
• Addgene，Plasmids 101: Blue-white Screening及Plasmids 101: Colony PCR，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：已读α互补、16–20小时显色、假阳/假阴及PCR只能作筛查。