蛋白透析换液：1 mL可溶蛋白的三次外液置换

02实验原理

小分子沿浓度梯度扩散，蛋白被膜大体截留。MWCO不是绝对筛子，应远低于蛋白大小；结合到蛋白的小分子、膜吸附与不充分平衡都会影响实际去除。外液更换比单纯延长同一桶时间有效。

04材料与仪器

His-GFP样本1 mL、10 kDa即用无针透析器、至少650 mL目标缓冲液、三只清洁250–500 mL容器、搅拌子、冷室、量取体积与测电导/pH设备、蛋白定量及GFP荧光检测。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

确认目标蛋白在新缓冲中稳定；先保留输入50 μL另份，主实验实际1.00 mL。外液pH必须记录温度，Tris冷却后的pH与室温不同。装置容量要留余量容纳渗透体积变化，不能塞满。透析不以体积是否增加判断成功。

08逐步操作

1. 准备1 L目标缓冲液，混匀后测pH、温度和电导，取600 mL预冷，另留少量润膜与检测。
2. 记录样本1.00 mL、浓度、原缓冲组成及预计蛋白质量，检查无可见沉淀。
3. 检查透析器膜完整，按其已核实润膜需求将膜浸入目标缓冲约2分钟，不得浸泡盖口导致污染。
4. 排去装样口多余缓冲，以无针口缓慢装入1 mL样本，避免引入大量空气；关紧密封。
5. 将装置放入200 mL预冷外液，使膜完全接触外液、装样口按装置方向高于液面，检查无泄漏。
6. 4°C轻搅2小时，搅拌子不得触碰膜；记录开始、结束与外液温度。
7. 弃去第一外液前取小份留作漏蛋白检查，把装置移至新200 mL外液，4°C轻搅2小时。
8. 再取第二外液检测份，将装置转入第三份200 mL新外液，4°C轻搅12–16小时。
9. 结束后取出装置，吸去外壳液滴，检查膜及密封，轻轻回收样本到预冷低吸附管。
10. 量实际回收体积，不强行用“原1 mL”计算；检查是否浑浊、絮状物及漏液。
11. 测回收蛋白浓度、pH/电导及GFP荧光；原样与回收样使用各自基质空白和同一方法。
12. 检测第一外液是否有明显GFP荧光/蛋白，结合体积计算回收率；若去咪唑用于敏感反应，应以适当测定验证残留。
13. 标记样本新缓冲、体积、浓度及日期，按已验证稳定条件短期4°C保存；不要把理想模型数值写成实测残留。

09结果判断与质控

记录质量回收=回收浓度×实际体积/输入质量。电导接近新缓冲只说明可导电小分子趋于置换，不能特异证明咪唑完全去除。理想模型不包含膜吸附、蛋白结合与未平衡。沉淀须另统计，不能丢掉后仍称全回收。

10实验记录模板

11常见问题与排错

出现沉淀：检查新缓冲pH/盐与目标稳定性，可先小试渐进换液。严重损失：查膜破损、密封、MWCO及膜吸附。脱盐不足：复核每次完整换液与混合，必要时再换新外液，不依据时间单独判定。

12参考资料

旧来源：网络手册物理173–174页。现代核对：SUNY Upstate Medical University，Purification of Human Cytoplasmic Actins From Saccharomyces cerevisiae，Bio-protocol 2023，13:e4894，实际核对10 kDa透析器、4°C大外液过夜置换；另核对EMBL PEPCF的透析/缓冲稳定性原则，查阅2026-11-02；本文采用即用10 kDa无针器的受限教学设计。装置具体润膜与装样方向必须由该器具有效技术文件确认，不采用旧透析袋煮洗路线；理想平衡公式独立计算，绝不作为实测残留。