丽春红转膜检查：染色、全膜拍照与可逆脱色

02实验原理

Ponceau S与膜上蛋白可逆结合呈红粉色，用于看到整体转移、气泡空白和泳道加载情况。染后水洗降低背景，拍照后用TBS-T脱色，再进行封闭。丽春红不是目标蛋白特异检测，未见低丰度条带不等于未转移，也不能替代对特定分子量区域的验证。

04材料与仪器

• 已完成电转且未封闭的湿NC膜与泳道图，含BSA2/5 μg、样本和空白泳道；本例不从头制胶或转膜。
• 指定CST即用Ponceau S Staining Solution 20 mL、去离子水至少100 mL、下表定义的1×TBS-T至少100 mL。
• 有盖浅染色盒、低速摇床、洁净镊子、计时器、白光成像装置与透明湿膜托盘。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

核对膜没有被封闭；牛奶或BSA封闭后再总蛋白染色会引入额外蛋白背景。取得转膜记录及胶泳道图，确认BSA对照是电泳前上样并随胶转移，不在膜上临时补滴。准备足以让膜平铺的盒及编号。依据后续抗体流程安排封闭液，脱色合格后及时衔接，不让膜干燥。

08逐步操作

1. 确认电转设备断电并拔线，用镊子取出湿NC膜，标记方向、蛋白面与膜号，记录转膜结束时间。
2. 按表配100 mL 1×TBS-T，充分混匀；核对TBS不含酚，Tween终浓度0.1%，不把10%原液直接拿来洗膜。
3. 将膜蛋白面朝上平放在盒中，加20 mL去离子水轻摇约30秒，以去除残留可能妨碍染色的去污剂；弃水。
4. 沿盒边加入20 mL指定即用Ponceau S染液，完全覆盖膜，排除膜下气泡，不用枪头戳蛋白区域。
5. 室温20–25°C轻摇5分钟，记录起止；未充分显带时可按本体系延至10分钟，不能无限延长染色。
6. 将染液收集至指定废液容器，沿盒边加20 mL水轻摇1分钟，观察背景与红粉色条带。
7. 必要时换水继续短洗，总清背景时间约1–5分钟，以条带可辨为终点；每次记录，不把弱带洗到消失才拍照。
8. 保持湿膜，将其平放透明托盘；以白光拍下完整膜、所有泳道与方向标记，避免反光及局部过曝。
9. 保存原始全膜图及泳道图，标注样本、BSA2/5 μg、空白和气泡疑点；不要只裁取目标分子量附近一条带。
10. 将膜放回盒中，加20 mL 1×TBS-T，室温轻摇5分钟，收集洗液并换新液。
11. 按同样方式每轮换20 mL TBS-T、5分钟，本例先做3轮；仍可见红带则继续换液，实际轮数记入表格。
12. 确认肉眼已看不到红粉色蛋白带、膜仍湿润且完整，记录脱色终点；若背景持续异常，先查洗液和膜污染。
13. 立即转入已准备好的后续Western blot封闭步骤，注明已做丽春红及脱色次数，不让膜在台面风干。
14. 汇总转膜缺陷及后续检测的可用区域；明显气泡空白覆盖目标泳道时优先重新转膜验证，不能靠后期图像填补。

09结果判断与质控

可见的总蛋白谱、BSA阳性及低空白支持转膜检查可解释。均匀丽春红图不能排除某特定大小蛋白未转移，BSA单带正常也不证明所有大小蛋白均转移。只有在染色与成像线性、膜材质及样本基质等已验证后才可作相对总蛋白归一；本入门流程主要作定性检查。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全膜深红看不清

查是否已经封闭、染液是否正确及清背景是否充分；若已封闭，不能将此图用于原样总蛋白比较。

圆形无信号区

常与转膜时气泡或接触不良有关，检查对应胶和转膜夹层；不把圆形空白当生物学低表达。

弱样本无带而BSA正常

可能低于本染色能力或转移有问题，结合胶上残留及后续靶标检测；不靠无限延长染色证明蛋白不存在。

12参考资料

• 用户提供《分子生物学实验方法 老文档 仅供参考》PDF物理第37页及《分子生物学实验手册 来源网络仅供参考》PDF物理第91页：膜上可逆染色线索；不采用其“TCA 3% v/v”不清楚配方，也不把膜考马斯染色与丽春红混用。
• Cell Signaling Technology，Ponceau S Staining Solution：Product Usage Information，查阅日期2026-11-02：已核对NC/PVDF适用、即用不稀释、室温5–10分钟、水洗1–5分钟、全膜拍照及TBS-T每轮5分钟至红带消失；本文固定NC、20 mL、对照和记录表为教学设置。