质粒小提：K-12 DH5α携带pUC19的GeneJET流程

02实验原理

碱裂解释放质粒，温和中和使染色体及蛋白沉淀；上清质粒吸附柱膜后洗脱。裂解后涡旋会增加染色体污染，超过5分钟会损伤超螺旋DNA。多构象质粒在胶上多条带，不等同多个不同长度载体。

04材料与仪器

• 单克隆DH5α/pUC19、LB、100 mg/mL氨苄青霉素无菌储备液，≥15 mL培养管。
• K0502的重悬液、裂解液、中和液、RNase A、洗液、洗脱液和柱，乙醇。
• 37°C摇床、6800×g及13000×g离心设备、移液器、培养与提取记录、DNA定量及鉴定条件。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

确认选择标记为Amp、菌株为EndA低活性DH5α，不把EndA+菌株专门洗液步骤省略后冒称同等方案。核对RNase已加入重悬液、乙醇已加入洗液。裂解/中和液有盐析则37°C复溶并冷回25°C。培养容器至少为培养体积4倍，3 mL用15 mL或更大管。

08逐步操作

1. 标记菌株、质粒、单克隆来源、抗生素及日期。向培养管加2997 μL LB和3 μL Amp储备液，混匀。
2. 用无菌接种工具挑一个新鲜单克隆接入，37°C、200–250 rpm摇12–16小时，保留未接种培养基对照；对照混浊或样本来源混杂时停止提取。
3. 将3 mL培养物分批收在兼容管中，6800×g离心2分钟，弃上清，再收剩余培养物到同一沉淀；吸尽残余培养基。
4. 加250 μL含RNase的重悬液，用吹打或此时涡旋彻底分散至无团块；重悬不全会降低后续提取质量。
5. 加250 μL裂解液，立即轻轻颠倒4–6次，不涡旋；开始计时，溶液应变黏、稍澄清，总裂解时间不超过5分钟。
6. 加350 μL中和液，立即轻颠倒4–6次，形成均匀白色絮状物；不要把局部未中和的透明团块留在管底。
7. 13000×g离心5分钟，将清亮上清移到柱，避免吸入白色沉淀；总量约850 μL时先上600 μL离心1分钟弃流出，再上剩余液离心1分钟。
8. 加500 μL已含乙醇的洗液，13000×g离心1分钟，倒尽流出液；再以500 μL重复一次。
9. 空柱13000×g离心1分钟去乙醇，将柱移至新标记管，柱底不接触积液。
10. 膜中央加50 μL洗脱液，室温等2分钟，再13000×g离心2分钟，记录回收体积，弃柱。
11. 以同洗脱液作空白测DNA浓度，记录总量；浓度不等于身份正确，另按pUC19已知图谱安排诊断酶切或测序。
12. 电泳比较样本与已知pUC19，原始未切质粒的超螺旋/开环迁移不能直接按线性Marker判全长；有身份疑问暂停下游使用。
13. 将质粒分装−20°C，菌株库存按机构程序保存，标清载体、克隆号、浓度和盒位；工作区及活菌废物完成规定清理。

09结果判断与质控

应获得可追溯的pUC19 DNA，未接种培养基无混浊，提取量和质粒鉴定相符。上限20 μg是柱容量，不是保证产量。没有酶切/测序验证时仅称“疑似质粒制备物”，不把高浓度作为正确克隆证据。

10实验记录模板

11常见问题与排错

染色体污染

检查裂解后是否涡旋、培养是否过量和沉淀带入，按正确动作重提。

RNA背景高

核对RNase添加日期与储存，不能用延长碱裂解代替RNase。

产量低

先确认选择压力、载体拷贝和菌体量，禁止无限增加培养量超过柱容量。

12参考资料

• GeneJET Plasmid Miniprep MAN0012655 Rev.B：已核对培养、250/250/350 μL、裂解≤5分钟、洗液两次500 μL及洗脱50 μL/静置2分钟/离心2分钟。