酚氯仿PCR纯化：100 μL教学产物的去蛋白与浓缩

02实验原理

中性偏碱条件下DNA保留在水相，蛋白转到界面或有机相；再以氯仿降低酚夹带。醇沉淀依赖盐和DNA量，可能共沉淀短核酸；它不等同硅胶柱的尺寸选择性。

04材料与仪器

• 无色PCR样本100 μL及同批NTC，pH8 PCI25:24:1、氯仿:异戊醇24:1、3 M乙酸钠pH5.2、无水及70%乙醇。
• 10 mM Tris-HCl pH8.0、耐溶剂管、过滤头、16000×g离心机、荧光定量设备、1%胶。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

保存输入胶图，核对仅单一1 kb带；预留独立输入小份用于定量，不从100 μL待处理量内偷取后仍按100计算。确认酚为pH8、未氧化且在有效期内，S与B独立管操作。

08逐步操作

1. 标记S/B，记录各100 μL、预期片段1 kb和输入荧光浓度。
2. 在通风橱各加100 μL pH8 PCI，立即盖紧。
3. 颠倒或短涡旋30秒使充分接触，12000×g、室温离心5分钟，等待转子停稳。
4. 用新枪头取上层至新管，避开界面，量得V1；不反复用水追提残界面以免稀释污染。
5. 加与V1等体积氯仿:异戊醇，盖紧混30秒，再12000×g离心5分钟。
6. 将水相移新管，记录最终V；液体混浊时再离心分相，不吸入下层补量。
7. 加0.1V3 M乙酸钠，轻混，再加2.5V无水乙醇，颠倒10次。
8. −20°C放30分钟，随后16000×g、4°C离心20分钟，标记沉淀侧。
9. 缓慢吸去上清，加入500 μL70%乙醇覆盖沉淀，16000×g离心5分钟。
10. 再洗500 μL70%乙醇一次并同条件离心，短离心集残液，用小枪头吸去液滴。
11. 室温风干5–10分钟至无可见液滴，加30 μL Tris，室温15分钟轻吹重溶。
12. 同法定量S/B，取3 μL加适量上样液做1%胶，比较输入与产物的大小和额外带。
13. 计算回收质量与回收率，标注“未证明完全去引物/dNTP”；如后续酶反应受抑制，再做适配净化与对照。

09结果判断与质控

目标1 kb保持，B无目标带；回收率必须实测。吸光度高而荧光DNA低提示杂质，不能凭总吸光值宣称高回收。该方法无法把两个相近PCR条带变成单一目的产物。

10实验记录模板

11常见问题与排错

水相夹带溶剂

重新分相，使用新管和枪头；不要单靠延长风干修补。

回收低

复核输入、V及小沉淀吸失；保留B帮助判定背景。

克隆背景高

查引物二聚体与非目标片段，该路线没有可靠尺寸选择。

12参考资料

• 用户提供网络手册物理第29页“PCR产物纯化方法（酚/氯仿）”：核对传统路线，纠正“离心久酚沉淀”、NaAc浓度不明和rpm直接套用。
• Addgene，Purifying Plasmid DNA中Phenol-Chloroform Extraction of DNA Samples、Ethanol Precipitation，全文查阅2026-11-02：核对等体积、取上层水相、氯仿补抽及醇沉淀；本文限定100 μL并明确×g。