01本篇适用条件
从指导者已收集、计数的1×10⁶个普通非感染培养细胞（例如CHO-K1）沉淀开始；不包括人体取材、组织切取或感染细胞。每次一个样本S和一个无细胞PBS提取空白B，裂解500 μL，最终100 μL TE重溶。仅用于常规PCR、酶切和完整性教学，不保证100–200 kb。
02实验原理
EDTA限制核酸酶活性，SDS裂解细胞，蛋白酶K消化蛋白。碱性平衡酚/氯仿使DNA主要留于上层水相；氯仿再抽提降低酚夹带，再以盐和乙醇沉淀。水相取样时避免界面，比盲目反复抽提更能兼顾纯度与回收。
03安全与适用范围
穿实验服、护目镜并戴与SDS相容的手套；酚、氯仿均须由受训指导者在化学通风橱内带教，使用密封耐溶剂管，发生皮肤接触立即按本单位应急流程处理。含卤有机相、界面和污染枪头分别进入规定化学废物容器，不倒入水槽、不与漂白剂混合；乙醇及异丙醇远离火源。离心管和转子须适配所列×g，配平后运行，不把rpm直接视为×g。
04材料与仪器
- 已计数CHO-K1细胞沉淀、PBS、1 M Tris-HCl pH8.0、0.5 M EDTA pH8.0、5 M NaCl、10% SDS、20 mg/mL蛋白酶K、10 mg/mL DNase-free RNase A。
- pH8平衡酚:氯仿:异戊醇25:24:1、氯仿:异戊醇24:1、3 M乙酸钠pH5.2、无水及70%乙醇、TE。
- 2 mL耐溶剂管、宽口头、55°C水浴、12000–16000×g离心机、荧光定量和0.8%胶。
05配液与用量
| 项目 | 配方/加量 | 终浓度/核算 |
|---|---|---|
| 基础裂解液10 mL | 1 M Tris 100 μL、0.5 M EDTA 200 μL、5 M NaCl 200 μL、10% SDS 500 μL，水至10 mL | 10 mM Tris、10 mM EDTA、100 mM NaCl、0.5% SDS |
| 每管消化 | 基础裂解液495 μL、20 mg/mL蛋白酶K5 μL | 500 μL，蛋白酶K200 μg/mL；基础成分稀释为0.99倍 |
| 去RNA | DNase-free RNase A 10 mg/mL，2.5 μL | 总502.5 μL，约49.8 μg/mL |
| 初抽提 | PCI 502.5 μL | 等体积；总约1.005 mL |
| 沉淀例 | 回收水相V=400 μL：3 M乙酸钠40 μL、无水乙醇1000 μL | 加盐后约0.273 M；总1.44 mL，须2 mL管 |
| 洗/重溶 | 70%乙醇每次1 mL，两次；TE100 μL | 70%乙醇由7 mL无水乙醇以水补至10 mL |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| PBS洗涤与重悬 | 室温 | 15分钟 |
| 蛋白消化 | 55°C | 2小时 |
| RNase与分相 | 37°C 30分钟；室温离心 | 约1小时 |
| 沉淀/洗 | −20°C 30分钟；4°C离心 | 约1小时 |
| 重溶 | 4°C | 过夜 |
07开始前的准备
核对细胞身份与无感染性，保留准确计数记录。准备S和B同批加工。混合液含SDS时不可直接用吸光度推测DNA；预先配好基础裂解液，再现加蛋白酶K。只使用明确pH8平衡的核酸级酚，不用酸性RNA抽提酚。
08逐步操作
- 记录S为1×10⁶细胞；向S与B各加1 mL PBS，S轻柔悬浮，500×g离心5分钟，吸去上清。
- 各加495 μL基础裂解液及5 μL蛋白酶K，盖紧，轻颠倒10次直至悬液均匀。
- 55°C孵育2小时，每30分钟轻颠倒，记录是否仍见颗粒；不强吹打黏稠DNA。
- 降至37°C，加入2.5 μL RNase A，轻混，37°C孵育30分钟。
- 在通风橱各加502.5 μL PCI，盖紧，温和颠倒3分钟，使水相与有机相充分接触。
- 12000×g、室温离心10分钟，确认上下两相和界面，缓慢将上层水相移新管并测量V。
- 各加与V等体积氯仿:异戊醇，颠倒2分钟，同条件离心10分钟，将水相移新管、记录新V。
- 若界面仍明显，重复一次等体积PCI与一次氯仿抽提；每次按实际水相重算，记录回收损失。
- 按最终水相V加入0.1V 3 M乙酸钠和2.5V无水乙醇，轻颠倒10次，确认2 mL管有足够空间。
- −20°C放30分钟，16000×g、4°C离心20分钟；记录管铰链朝外以定位沉淀。
- 缓慢吸去上清，加1 mL 70%乙醇覆盖沉淀，16000×g、4°C离心5分钟；重复一次洗涤。
- 吸去可见残液，室温风干5–10分钟至无液滴；加100 μL TE，4°C过夜温和重溶。
- 用相同荧光法测S与B；约100 ng S上0.8%胶，另设DNA质量对照，保存胶图。
- 报告浓度、总量、完整性和空白；分装−20°C，收集所有酚/氯仿和醇类废物。
09结果判断与质控
DNA应以高分子量为主，明显拖尾提示剪切/降解，低分子条带提示RNA残留。A260/280约1.8和A260/230约2可作参考，但低浓度时比值易失真，不能代替荧光定量及下游测试。空白异常则该批回到污染定位。
10实验记录模板
| 样本/细胞数 | 消化起止/外观 | 各次水相V μL | 最终盐/乙醇μL | 重溶μL | 浓度/总量 | 胶/空白 | 下游测试 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| S/B | 待填 | 待填 | 0.1V/2.5V | 100 | 待测 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
水相少或难分层
确认管容量、颠倒混合与离心条件；按实际V继续，不取界面补体积。
DNA呈碎片
检查起始细胞质量、核酸酶与裂解后强混，重新做温和处理。
浓度高但PCR差
排查酚、SDS、盐或乙醇残留，以1:10稀释和独立DNA阳性比较，必要时重新净化。
12参考资料
- 用户提供网络手册物理第6页末、第7–8页：核对培养细胞酚抽提路线；将不清晰的裂解液改写为可复算的SDS质量/体积配方，限于已收集培养细胞。
- Addgene，Purifying Plasmid DNA中Phenol-Chloroform Extraction of DNA Samples及Ethanol Precipitation，网页查阅2026-11-02：核对等体积抽提、上层水相、后续氯仿及醇沉淀。
- OpenWetWare，Phenol/chloroform extraction，网页查阅2026-11-02：核对100–700 μL水相范围与酸性酚导致DNA损失的边界。本文500×g细胞沉降、55°C 2小时及明确×g为所限定教学流程。
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做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。