PCR污染定位：分区、试剂替换与擦拭对照

02实验原理

替换实验每次只改变一个因素，若全新NTC阴性而某旧组分替换管阳性，则该组分或其操作链可疑；必须独立复测。阴性不能证明绝对无污染。UNG仅可防范既往含dU产物，不能清除普通dT质粒或所有来源DNA，因此本例先用物理分区与新试剂定位。

04材料与仪器

• 新、旧两套对应GoTaq组分及10 μM引物，新水、已知无害教学模板1 ng/μL。
• 无DNA棉签、1.5 mL管、清洁用有效氯0.5%工作液、纯水、计时器。
• 专用清洁区移液器、过滤枪头、热盖PCR仪、1.5%胶及梯。

05配液与用量

100 μM引物工作液以10 μL储备加90 μL水配成10 μM。N管共用混液按N×1.1份配，模板不加入混液；每管分24 μL再加1 μL模板/水。

10管做11份时不含模板混液264 μL；旧组分替换管须单独配24 μL，不能从含新组分混液中再加旧组分。

06时间安排

07开始前的准备

先暂停可疑批次结果解释，把原始NTC胶图、试剂批次和人员动线存档。建立A纯试剂区、B加模板区、C扩增/开管区，物品与人员单向A→B→C；回A前更换手套和外层衣物。新试剂由未接触产物的操作者分装，清理前先采样。

08逐步操作

1. 保存原失败批胶图，标记NTC的大小和亮度，将旧组分封存并编号，不继续分装传播。
2. 画三工作区与人/物移动路线，移走A区全部模板、质粒和扩增产物，器材逐区专用。
3. 给十管编号并写出唯一变量；对全新NTC与阳性使用同一已核验引物对和58°C起点。
4. 清理前用润湿棉签擦可疑台面10×10 cm，放200 μL新水，轻涡旋30秒，取1 μL为模板。
5. 用未接触台面的同批棉签做空白，独立处理；记录台面位置、面积与取样时间。
6. 在A区配全新NTC、擦拭管及空白、不含酶管，封好；可疑旧组分在独立位置单管配制，不返回A区。
7. 各管加1 μL对应水、擦拭液或1 ng模板，补到25 μL；无酶管以水替代酶，核对管位。
8. 95°C2分钟；30循环95°C30秒/58°C30秒/72°C30秒；72°C5分钟，全程闭管转移至C区。
9. 在C区各取5 μL产物加1 μL6×液上1.5%胶，梯与原失败批预期大小并列判读，保存未裁切图。
10. 清理可耐氯台面：先去可见污物，再用0.5%有效氯保持湿润10分钟，用水擦去残留；设备不耐氯部分按相容去DNA方案处理。
11. 隔离可疑试剂并更换小份，完成清理后另一天独立重复全新NTC双管、阳性和擦拭空白，保留各批记录。
12. 只有阳性成功、两次全新NTC均无目标带、擦拭空白干净才恢复教学批次；失败时继续检查器材、人员动线及尚未测的旧酶/dNTP。
13. 给结论分级为“疑似来源/复测支持/仍未定位”，不因一次阴性宣布污染完全消失。

09结果判断与质控

阳性应出现500 bp条带；无酶管有带提示混入可直接成像的产物或上样错误。全新NTC也阳性时，本批不能归因于单个旧试剂。擦拭液阴性受采样效率与抑制影响，不证明环境绝对洁净。

10实验记录模板

11常见问题与排错

所有NTC阳性

查新试剂开盖区域和移液器，不继续用该批定位单一来源。

只有擦拭管阳性

独立位置再次采样复测，核对棉签空白；不要只喷酒精后结束。

阳性失败

本批阴性无解释力，先查酶、引物及程序，必要时稀释擦拭液评估抑制。

12参考资料

• 用户提供网络手册物理第26–29页：核对污染来源、分区与擦拭思路；纠正可免NTC、5 mL进PCR、UNG去除任何来源污染等表述。
• Addgene，Polymerase Chain Reaction与Plasmids 101: Colony PCR，全文查阅2026-11-02：核对无模板、已知模板和阴性载体对照及主混液操作。
• Promega，GoTaq G2 DNA Polymerase Product Information，9PIM784，修订03/18：已读50 μL体系、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM各dNTP、0.1–1 μM引物、约1分钟/kb延伸及25–30循环；本文按体积减半，保留相同酶浓度。