oligo(dT)纯化mRNA：生物素寡聚dT与链霉亲和素磁分离

02实验原理

oligo(dT)先与poly(A)尾退火，生物素端与链霉亲和素磁粒结合，磁吸去掉未结合RNA。低盐水解离dT:A配对洗脱mRNA。富集不是绝对纯化，部分rRNA残留或短poly(A)尾丢失需实测。

04材料与仪器

• PolyATtract小规模体系的生物素oligo(dT)探针、链霉亲和素磁颗粒0.6 mL/反应、20×SSC、RNase-free水；RNA200 μg。
• 65°C热块、适配1.5 mL管的磁架、RNase-free耗材和RNA定量/电泳或RT-qPCR条件。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

磁粒不得冻结、干燥或重复使用。轻颠倒检查完全悬浮，若3分钟内明显沉团且不能分散则换新。保留输入小份用于质控，实验管仍应有200 μg；留流穿和洗脱直到确认回收。

08逐步操作

1. 标记输入S、流穿FT、第一洗脱E1、第二洗脱E2及空白B；记录总RNA浓度、完整性与200 μg质量。
2. 将200 μg RNA以RNase-free水补至500 μL，65°C加热10分钟，不把浓缩RNA直接加到磁粒上。
3. 加入3 μL体系自带生物素oligo(dT)和13 μL20×SSC，轻混，室温冷却至约20–25°C，最多约10分钟。
4. 按表新配0.5×和0.1×SSC，轻混，确认分别是30/1200及7/1400的稀释。
5. 完全重悬0.6 mL磁粒，置磁架约30秒至溶液变清，缓慢吸掉储存上清。
6. 加300 μL0.5×SSC，离开磁架轻弹重悬，再磁吸去上清；共做三次预洗。
7. 将预洗磁粒重悬于100 μL0.5×SSC，预洗结束30分钟内进入捕获。
8. 将516 μL全部退火液加入磁粒悬液，室温10分钟，每1–2分钟轻颠倒混匀。
9. 放磁架至磁粒聚集、上清清亮，取走上清到FT管，不触碰磁粒条带。
10. 离开磁架，加300 μL0.1×SSC完全重悬，磁吸去液；重复共四次，最后尽量去残液。
11. 加100 μL RNase-free水，轻弹完全重悬；磁吸至澄清后取上清至E1，不丢磁粒。
12. 再以150 μL水重悬、磁吸，取E2并与E1合并，记实际总体积约250 μL。
13. 若看见磁粒带入产物，12000×g离心1分钟，取无粒上清到新管；记录可能的体积损失。
14. 定量输入、FT和洗脱液，计算洗脱质量；用rRNA与已知poly(A)转录本的RT-qPCR或电泳评价富集，不把总质量当纯度。
15. 小份分装−80°C；在确认回收/富集前保留FT，失败时追踪RNA是未结合还是未洗脱。

09结果判断与质控

获得的应为poly(A)富集RNA，不能承诺固定百分比回收或完全无rRNA。低量产物用适合低浓度RNA的荧光法；若用吸光法接近背景，报告低于定量范围而非“0”。结果适用于含poly(A)转录本，不代表全部转录组。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

FT有大量目标

查RNA解链、SSC浓度、探针/磁粒是否适配及RNA过量。

产物有磁粒

按步骤13清除；磁粒不可进入后续光学或酶反应。

rRNA仍明显

检查洗涤和RNA完整性；单次富集不保证绝对纯。

12参考资料

• 旧网络手册物理第139–140页：poly(A)-oligo(dT)亲和原理；旧1 M EDTA和自装柱条件未采用。
• Promega，PolyATtract mRNA Isolation Systems Technical Manual，修订2012-12，物理第9–10页，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：已核小规模500 μL、3 μL探针、13 μL20×SSC、0.6 mL磁粒、三预洗四洗及100+150 μL洗脱。该路线替换旧纤维素柱，正文明确区分。