核质蛋白分离：低浓度NP-40的REAP教学流程

02实验原理

低浓度非离子去污剂配合短时混匀释放胞质，完整细胞核沉降。核沉淀不是“绝对纯核”，胞质上清也不是所有非核蛋白；要看Lamin A/C与α-tubulin等双向污染标志，而不是只看目标条带出现在哪管。

04材料与仪器

• 一皿10 cm NIH/3T3细胞、冰冷1×PBS、10% NP-40储备、标记W/C/N管。
• 4×还原Laemmli上样液、水、冰盒、冷冻微量离心机、宽口P1000枪头。
• 用于形态检查的相差显微镜；WB质控抗体为已验证小鼠样本的Lamin A/C和α-tubulin，另测目标蛋白。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先画W/C/N流向和细胞当量计算，避免按相同μL直接比较组分。预冷PBS、分离液、离心机并标三管；确认0.1% NP-40不是0.5%，后者可能破坏核。需有本机短离心实际运行方式，某些设备加减速已超过10秒，应先验证而非仅输入10秒。

08逐步操作

1. 去培养基，用冰冷PBS约5 mL轻洗一次后弃去，保持细胞皿冰上，不让细胞长时间干燥。
2. 加1 mL冰冷PBS，用细胞刮轻收至1.5 mL管。本机预验证5000×g短转10秒收细胞，吸去PBS，记录操作起点。
3. 向沉淀加900 μL冰冷0.1% NP-40/PBS，P1000缓慢上下吹打5次至分散，不涡旋也不长时间孵育。
4. 立即取300 μL到W管，加100 μL 4×上样液，轻混并冰上放置；原管剩600 μL供分级。
5. 原管按本机已验证5000×g10秒短转，使核沉降；小心取上层澄清液300 μL至C管，不碰核沉淀。
6. 向C管加100 μL 4×上样液，混匀，记录总体积400 μL。剩余胞质液从原管轻轻吸尽，既不带走核也不把残液当成核体积。
7. 向核沉淀加1 mL冰冷0.1% NP-40/PBS，轻吹打5次重悬，按同一短转条件离心10秒，弃上清完成一次核洗。
8. 在验证阶段，另取少量洗后核悬液作显微镜形态检查，核应完整而非大量碎裂；必要取样量及损耗写入细胞当量计算。
9. 核沉淀本例约20 μL，加入50 μL 4×上样液及130 μL水成约200 μL N样本；沉淀差异大时重新按最终1×和总体积计算，不照抄。
10. W/N若黏稠，应先采用本实验室对该装置验证的短脉冲剪切参数，记录探头、功率、时长及冷却。没有验证参数时先建立质控，不能用任意超声能量破坏样本后继续比较。
11. 三管95°C加热5分钟并短暂收液。取W10 μL、C10 μL、N2.5 μL，加1×上样液补相同上样总体积；这是针对本例取样比例的等细胞当量比较。

    

12. 同膜或平行膜检测Lamin A/C及α-tubulin，均以本地验证抗体条件进行；核marker应主要在N、胞质marker主要在C，W含两者。明显交叉污染则该分离批次不放行。
13. 纯度通过后再看目标在核/胞质的分布，保留所有分级体积和取样损耗；相互不同总体积的C/N原始条带强度不能直接当作核质总量比。

09结果判断与质控

成功终点是可复核体积关系、完整核形态及双向marker支持足够纯度。α-tubulin不是所有处理下绝对不入核的普适标志，Lamin也不是核内全部蛋白；必要增加第二组标志。若处理改变细胞大小、核体积或裂解敏感性，须重新验证而非直接把条带变化称为转位。

10实验记录模板

11常见问题与排错

核marker进入胞质

查去污剂浓度、吹打过强、处理延时及核破裂，缩短并重新验证。

胞质marker大量留核

查未裂解细胞、核洗不充分及沉淀夹带，增加盲目洗涤也会损失核蛋白，需配合形态验证。

目标两管都有

可能真实分布或污染；先看marker和细胞当量，不能凭目标本身判断分离成功。

12参考资料

• Suzuki等，REAP nuclear/cytoplasmic fractionation，PMC2993727：已读900 μL、300 μL取样、低NP-40和双marker验证。本文明确改写短转RCF、核上样液及等细胞当量计算，需本机验证，不冒称原文已给出这些数值。