DIG-LNA小RNA Northern：尿素胶、EDC固定与化学发光

02实验原理

尿素PAGE分离短RNA，EDC促进带5′磷酸的小RNA在尼龙膜上固定，LNA探针提供短序列识别；DIG由碱性磷酸酶抗体与CSPD检测。目标阴性、长度标记和加载参照需共同判断，检测到一条带不自动证明其序列身份。

04材料与仪器

• 总RNA、已知目标阳性RNA、经确认无目标的阴性或错配探针、短RNA长度标记、以1×ULTRAhyb配制的DIG-LNA工作液5 nM、ULTRAhyb、正电尼龙膜。
• SequaGel三组分、10%APS、TEMED、2×尿素变性上样液；1×TBE、甲基咪唑、EDC盐酸盐、HCl、SSC/SDS；即用DIG封闭液、anti-DIG-AP、DIG洗液、显色缓冲液、CSPD。
• 10.1×7.3 cm、1.5 mm小胶装置、冷却半干转膜、60°C孵育设备与化学发光成像。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

安排S、P、阴性N、长度标记与加载参照泳道，RNA批次需完整无明显降解。EDC、LNA序列和探针浓度固定为本路线，先有可检测P才评价S。先准备甲基咪唑/EDC通风区与小RNA专用转膜材料，不能沿用旧手册甲醛胶条件。

08逐步操作

1. 根据目标和阳性RNA画泳道，检查5 μg RNA是否可置于5 μL；低浓度样本先用经验证方法浓缩后重新定量。
2. 按表配15%胶，加入APS/TEMED后立即灌1.5 mm胶，插梳，室温聚合至少1小时。
3. 装1×TBE，以200 V预跑60分钟；冲洗加样孔去尿素，检查无漏液和过热。
4. 每管5 μg RNA水补5 μL，加5 μL2×变性上样液，95°C5分钟，立即置冰并短离心。
5. 加样10 μL并上短RNA标记，200 V电泳约50分钟，溴酚蓝距胶下缘约1 cm停止，记录实际时长。
6. 正电尼龙膜及滤纸用1×TBE湿润，按核酸移向阳极方向夹胶和膜，轻滚去气泡；冷却条件下10 V半干转90分钟。
7. 现配24 mL EDC液并确认pH8.0，滤纸饱和后放膜，RNA面朝上，塑料膜包住保持湿润。
8. 60°C孵育2小时固定，取出后用无RNase水洗去残余EDC；标膜方向，不在固定前烘干。
9. 加10 mL ULTRAhyb，37°C预杂交至少30分钟；将以1×ULTRAhyb配制的5 nM DIG-LNA工作液95°C1分钟。
10. 换10 mL含最终0.5 nM探针的杂交液，37°C缓慢摇动12–16小时，始终完全润湿膜。
11. 37°C用2×SSC/0.1%SDS洗两次各15分钟，再0.1×SSC/0.1%SDS洗两次各5分钟，最后1×SSC10分钟。
12. 室温以即用DIG封闭液充分覆盖膜并轻摇封闭3小时；按表配1:15000 anti-DIG-AP。
13. 加抗体液室温30分钟，随后用1×DIG洗液洗四次各15分钟；各次用足量新液完全覆盖膜。
14. 显色缓冲液平衡5分钟，加1:100 CSPD覆盖5分钟，去余液包膜，37°C孵育15分钟。
15. 按短至长曝光成像，保存全膜与P/N；用长度标记核对约22 nt带，曝光饱和者不做灰度定量。
16. 另用经验证的稳定小RNA/独立膜加载参照检查输入差，报告目标与参照原始信号、归一方法及独立样本数。

09结果判断与质控

P出现目标大小信号、阴性/错配探针背景低且加载参照合理才有解释基础。小RNA条带可有成熟体与前体，需按长度和探针区分；不能以本法短RNA结果替代长mRNA Northern。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

小RNA无信号

查P、RNA5′端性质、EDC配制与转膜方向；普通UV固定并非本例等效替代。

全膜背景高

检查探针浓度、封闭和洗膜；参考补充图S2，单变量优化并保留阳性。

带拖尾

检查RNA过量、盐、变性及胶温，不凭裁剪图删除拖尾。

12参考资料

• 旧网络手册物理第83–87页：Northern原理与非放射检测线索；旧甲醛长RNA路线由明确标注的短RNA现代等效路线替代。
• Kim等，A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs，Nucleic Acids Research，2010，PMC2853138；已读正文与Supplementary Methods物理第10–18页，查阅2026-11-02：已核15%尿素胶、EDC24 mL配方、37°C0.5 nM LNA、洗膜、1:15000抗体及1:100 CSPD；采用详细补充条件，不宣称适用于任意探针。