01本篇适用条件
本例使用HeLa CCL-2和Dojindo JC-1 MitoMP Detection Kit MT09，ibidi八孔成像板，每孔200µL，常规EMEM+10%FBS、37°C/5%CO₂。厂家给出的JC-1候选范围1–15µM、染色30–60分钟；本页选2µM/30分钟，并将CCCP安排在染后以验证动态响应，此顺序为教学选择。红绿比反映本体系的相对变化，不直接测得毫伏值，也不能单独诊断凋亡。
02实验原理
较高膜电位有利于红色J聚集体，去极化时红/绿比通常降低。样本密度、染料浓度、温度、线粒体质量和曝光均会影响结果。必须设置无染背景和可响应的去极化控制，按单细胞或一致ROI计算扣背景红/绿比，不用不同孔自动曝光后的亮度直接相比。
03安全与适用范围
HeLa按BSL-2培养。JC-1和CCCP按SDS避免吸入和皮肤接触，CCCP为有毒去偶联剂，使用小体积已配母液；DMSO注意防渗透。荧光样本废液单独收集。
04材料与仪器
MT09完整套装；HeLa；EMEM完全培养基、HBSS、DMSO；预先配好且标明浓度的10mM CCCP/DMSO母液；ibidi八孔板；37°C培养箱；能分辨绿色500–550nm及红色约570–620nm信号的显微镜。
05配液与用量
| 配液 | 用量 | 结果 |
|---|---|---|
| JC-1母液 | 整管100nmol染料加50µL DMSO | 2mM；分装避光 |
| JC-1工作液1mL | 2mM母液1µL+完全培养基999µL | 2µM，DMSO0.1% |
| 成像缓冲液2mL | 套装10×液200µL+水1800µL | 1×，当天使用 |
| 去极化候选1mL | 10mM CCCP母液1µL+1×成像缓冲液999µL | 10µM CCCP、0.1%DMSO |
| 载体候选1mL | DMSO1µL+成像缓冲液999µL | 相同DMSO0.1% |
| 每孔 | 200µL染液；洗后200µL成像/控制液 | 候选铺板2×10⁴活细胞/孔 |
CCCP10µM、20分钟为需要预试的候选；不能因控制未响应就无限加量。染料原液和培养基先回室温，按说明先取母液再加培养基并立即吹匀约10次。
06时间安排
| 时间 | 操作 |
|---|---|
| 前一天 | 2×10⁴细胞/200µL铺八孔板 |
| 当天 | 2µM JC-1，37°C30分钟 |
| 随后 | HBSS洗2次，再加成像缓冲液或CCCP液 |
| 20分钟后 | 相同设置拍红/绿，CCCP后不再洗 |
07开始前的准备
每条件至少3孔，无染和载体控制必备。先确认2µM在本细胞中有清楚但不饱和信号，再预试CCCP响应窗口。MT09说明特别提醒去极化后洗涤可能改变膜电位，本页先染、洗，再加去极化液，之后不洗；不要与其他先处理后洗的流程随意拼接。
左侧示意把少量DMSO母液加入预置的大体积水相，右侧叉号提示避免反向加入造成局部高浓度。此图解释加液方向，实际2 mM母液和工作浓度按正文与手册配制。来源为Dojindo技术说明书，非商业推广。
08逐步操作
- 八孔板每孔铺200µL、1×10⁵活细胞/mL悬液，过夜至细胞贴壁且未过密。
- 显微检查形态，留出无染孔；若已大量漂浮或死亡先解决起始状态，不继续解释膜电位。
- 将JC-1母液和培养基回室温，取1µL2mM母液，加入999µL培养基，立即混匀约10次，现配避光。
- 轻柔吸去旧液，每个待染孔加入200µL2µM染液；无染孔加等量载体培养基，时间与温度一致。
- 37°C、5%CO₂避光30分钟，不长时间开盖放在显微镜旁染色。
- 去染液，沿壁加200µL HBSS轻洗，再重复一次；不用PBS替代，避免增加细胞应激。
- 研究及基础载体孔加入200µL1×成像缓冲液或相应载体液；去极化孔加入200µL10µM CCCP成像液。
- 在相同温度条件下等待20分钟，记录实际起止；CCCP加入后不再洗涤，维持各孔终体积200µL。
原图按时间顺序显示一般染色流程。该图的常规洗涤箭头不能代替正文“染后再去极化”的特殊处理规则；若处理后洗涤会改变膜电位，应遵循正文与现用说明书的限制。来源为Dojindo技术资料，非商业推广。
JC-1 MitoMP Detection 技术说明书，General Protocol workflow厂商版权；公开技术手册局部摘录，非商业推广；未声明开放许可查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 先用无染孔测两通道背景，用健康和去极化控制选取均未饱和的曝光，之后对所有样本固定设置。
- 每孔拍5个预设视野，绿色建议488nm激发/500–550nm收集，红色采用仪器适合J聚集体的通道，记录实际滤光片。
完整保留HeLa对照与FCCP 100 μM两面板。来源处理90分钟后染色，与本篇染后10 μM CCCP 20分钟的设置不同；该图只说明去极化时红绿分布改变，不提供本篇阳性控制参数。
Dojindo，JC-1线粒体膜电位技术手册，Figure 2来源机构版权；公开技术资料完整图摘录，未声明开放许可；仅去除非数据目录编号点击图片查看原图 ↗
原图为Jurkat正常与诱导凋亡的完整双面板，来源采用星形孢菌素处理体系。细胞株和诱导条件不同于本篇HeLa去极化控制，不能照搬曝光、强度或阳性比例。
Dojindo，JC-1线粒体膜电位技术手册，Figure 3来源机构版权；公开技术资料完整图摘录，未声明开放许可；仅去除非数据目录编号点击图片查看原图 ↗ - 对相同细胞ROI分别扣局部背景，红/绿比=净红信号÷净绿信号；绿信号接近背景时标记不可计算，不生成巨大比值。
完整保留来源Jurkat的红/绿荧光比，显示其诱导凋亡体系下比值降低。来源为板读总体比值，本篇为成像ROI逐细胞比值；两者的绝对数值、汇总方式和阈值不能直接比较。
Dojindo，JC-1线粒体膜电位技术手册，Figure 4来源机构版权；公开技术资料完整图摘录，未声明开放许可；仅去除非数据目录编号点击图片查看原图 ↗ - 每孔先汇总单细胞比值，再比较独立批次；保存原图、背景与去极化响应，结合细胞活率解释。各组拍照顺序轮换，记录离箱到成像的分钟数，减少温度与等待差异。
完整保留红绿荧光双参数及两群细胞，来源为Jurkat诱导凋亡体系，不是HeLa成像结果。流式散点分布不等同本篇显微ROI分析，也不能将图中分群直接作为本机门限。
Dojindo，JC-1线粒体膜电位技术手册，Figure 5来源机构版权；公开技术资料完整图摘录，未声明开放许可；仅去除非数据目录编号点击图片查看原图 ↗
09结果判断与质控
例：健康ROI净红800、净绿400，比值2.0；控制净红200、净绿500，比值0.4，符合去极化方向。原始强度单位仅在相同采集条件下可比；不能称为膜电位由2.0伏降到0.4伏。
对照组可见红色聚集体，原手册CCCP组以绿色为主，示意去极化时红/绿分布的变化。原图使用100 µM CCCP、90分钟等原手册条件，和本篇10 µM、20分钟候选不同；不能作为本篇结果或验证本篇处理有效。来源为Dojindo技术资料，非商业推广。
10实验记录模板
| 样本/孔 | 细胞数/形态 | JC-1批号/浓度 | 染色时间 | CCCP/载体起止 | 净红/净绿/比值 | 滤片曝光/图号/异常 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
11常见问题与排错
红绿全弱：查溶解混匀、染料保存、温度与细胞状态。红点沉淀：查浓度、稀释顺序和不溶颗粒，不把沉淀计作线粒体。CCCP后比值不变：检查控制母液和洗涤顺序，重新预试，不通过自动曝光制造差异。
12参考资料
- Dojindo：MT09官方说明书，已读取2mM母液、1–15µM范围、30–60分钟、HBSS洗涤和去极化后不洗的限制。
- ATCC：HeLa CCL-2。染后CCCP10µM/20分钟、铺板量和ROI规则为本页教学设置。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。