01本篇适用条件
使用指导者提供的2 μg纯化非感染性教学DNA；其限制图谱已知，其中含核心已知区的EcoRI片段为约1.5 kb，且核心区及两条引物结合位点内部无EcoRI位点。外向引物位于已知区两侧，围绕环扩增预计1.2 kb。本例用于验证方法；未知复杂基因组须先做多种酶的图谱评估，不用于病毒整合位点。
02实验原理
限制酶将线性DNA切成片段，低DNA浓度下促进同一片段自身环化，背向引物便可跨越限制连接接头。反向PCR与普通质粒全长突变PCR不是同一应用；没有预先建立的限制图谱不能直接承诺产物大小。无连接酶和未环化模板对照检验是否依赖环化。
原图完整保留PCR循环与扩增示意。它用于理解分子过程；本篇温度、时间与循环次数以已限定Taq和模板的正文程序为准。
03安全与适用范围
样本仅为已知无害教学DNA或明确的非致病实验室株。戴实验服、手套，使用过滤枪头；配液、加模板和开扩增管用分开的器材与区域，扩增管只在产物区打开。凝胶和核酸染料按本地SDS处理；优先蓝光成像，断电后开电泳槽。扩增阳性不代表序列正确。
04材料与仪器
- 无害教学DNA、EcoRI-HF（20 U/μL）与10×rCutSmart、T4 DNA连接酶（400 cohesive-end U/μL）及含ATP的10×配套液。
- 已验证外向引物10 μM、GoTaq G2体系、DNA清理装置、Tris、1%胶、荧光定量。
- 37°C和16°C温控、离心机、热盖PCR仪。酶制剂不得在不同单位定义间互换。
05配液与用量
| 阶段 | 配方 | 核算 |
|---|---|---|
| EcoRI酶切50 μL | DNA2 μg（100 ng/μL，20 μL）、10×液5 μL、EcoRI-HF1 μL、水24 μL | 20 U、1×液 |
| 环化100 μL | 纯化限制片段10 ng（1 ng/μL，10 μL）、10×连接液10 μL、T4连接酶1 μL、水79 μL | DNA0.1 ng/μL；400 cohesive-end U |
| 无连接酶100 μL | 同环化但以1 μL水替酶 | 同DNA浓度 |
| PCR25 μL | 见下表；模板取纯化环化物或对应无酶物1 μL | 另设NTC和已验证环状阳性 |
| 每25 μL反应 | 加量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 5×Colorless GoTaq反应缓冲液 | 5 μL | 1×；MgCl₂ 1.5 mM，不再盲加镁 |
| dNTP，四种各10 mM | 0.5 μL | 每种0.2 mM |
| 正向引物10 μM | 0.5 μL | 0.2 μM |
| 反向引物10 μM | 0.5 μL | 0.2 μM |
| GoTaq G2，5 U/μL | 0.125 μL | 0.625 U；用总混液避免单管吸0.125 μL |
| 模板或水 | 1 μL | 见正文指定 |
| 无核酸酶水 | 17.375 μL | 总25 μL |
100 μM引物工作液以10 μL储备加90 μL水配成10 μM。N管共用混液按N×1.1份配，模板不加入混液；每管分24 μL再加1 μL模板/水。
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 酶切/胶与纯化 | 37°C1小时，胶分离 | 约2小时 |
| 稀释环化 | 16°C | 4小时 |
| 净化/扩增 | PCR约90分钟 | 2小时 |
| 接头测序 | 送测及回读 | 另1–2天 |
07开始前的准备
酶切后在胶上回收含已知区的1.5 kb片段并准确荧光定量，避免高浓度全基因组直接环化造成串联体。两外向引物的5′→3′序列及方向须画在原片段上，确认跨环产物1.2 kb且引物Tm支持58°C。若用其他限制酶，重新核对缓冲液、甲基化敏感性及切点，不能照搬EcoRI条件。
08逐步操作
- 记录输入DNA、限制图谱和外向引物位置，明确1.5 kb限制片段及1.2 kb预期环扩增大小。
- 在冰上按表配50 μL EcoRI-HF反应，最后加酶，轻混短离心。
- 37°C反应60分钟，取5 μL上1%胶并以未切DNA对照检查消化。
完整保留EcoRI识别序列、5′/3′方向、双链切割箭头及产生的两端。它只说明交错切口与黏端；本篇具体酶、缓冲液、酶量和限制图谱以正文为准，不从此示意推断产物长度。
Addgene，Restriction Digest of Plasmid DNA，EcoRI识别与切割图来源机构版权；公开技术资料完整图摘录，未声明开放许可；不含商品推广点击图片查看原图 ↗ - 对剩余酶切物做制备胶，蓝光下回收约1.5 kb目标片段，纯化到30 μL并定量，记录实际产量。
- 将片段稀释为1 ng/μL，配100 μL环化与100 μL无连接酶对照，每管10 ng DNA。
- 16°C连接4小时，保持管密封，随后分别净化到30 μL Tris，不自行假定某温度通用灭活全部酶。
完整保留两段DNA、相容黏端、连接箭头与产物。原图以EcoRI的AATT末端示范分子间连接，不代表本篇最终构建或实测效率；反向PCR篇的低浓度自环属于分子内连接，两种连接结构须区分。
Addgene，DNA Ligation，EcoRI黏端连接示意来源机构版权；公开技术资料完整图摘录，未声明开放许可；不含商品推广点击图片查看原图 ↗ - 准备四管PCR：环化物L、无连接酶NL、已确认相同环模板P、无模板N；每管24 μL混液。
- 各管加1 μL对应模板/水，使用外向引物，最后加入P模板并封管。
- 95°C2分钟；30循环95°C30秒、58°C30秒、72°C90秒；72°C5分钟。
- 在产物区每管5 μL加1 μL6×上样液，上1%胶并加梯，5 V/cm分离。
- 仅在P正常、N干净且L出现预期带时回收L目标产物；NL应无目标或明显弱于L，异常需复做。
- 对纯化产物从已知区双向测序，核对限制连接接头和侧翼顺序，确认不是串联体或非目标片段。
- 保存酶切图、环化DNA浓度、PCR图和序列比对，报告实际证实的侧翼长度，不把整条胶带视为已知序列。
09结果判断与质控
L预计约1.2 kb，P有效且N阴性。环化和扩增本身不保证侧翼唯一，最终以跨接头序列确认。若复杂基因组中出现多带，应分别鉴定并回查限制设计，不随机挑最亮带当真。
10实验记录模板
| DNA/图谱 | 酶切量/时间 | 回收ng/μL | 环化ng/μL | L/NL/P/N带型 | 接头测序 | 侧翼确认bp |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 2 μg/60分钟 | 待测 | 0.1 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
L无带且P正常
检查片段回收、连接缓冲液ATP及外向引物相对切点；设置更短目标验证。
NL也有带
检查残留原环状模板与非特异扩增；不能略去该对照。
多带
降低复杂性或重新选限制片段，并逐带测序；不以条带数推断整合事件。
12参考资料
- 用户提供网络手册物理第25–26页：读取背向引物、限制切割与环化原理；本例替换为无害教学限制片段。
- Addgene，Restriction Digest of Plasmid DNA及DNA Ligation，已有全文，查阅2026-11-02：核对共用缓冲液、酶量/甘油、片段纯化、摩尔及质量浓度、ATP与无插入/无酶对照；本文0.1 ng/μL环化为限定教学起点。
- Promega，GoTaq G2 DNA Polymerase Product Information，9PIM784，修订03/18：已读50 μL体系、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM各dNTP、0.1–1 μM引物、约1分钟/kb延伸及25–30循环；本文按体积减半，保留相同酶浓度。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。