包涵体溶解与小规模稀释复性：His-GFP条件筛查

02实验原理

尿素破坏非共价作用使聚集体溶解，降低尿素及蛋白浓度让分子重新折叠；稀释同时减少分子间再聚集。澄清、可溶与天然功能三者不同，必须检测GFP荧光并核对可溶回收率。

04材料与仪器

10 mg已洗His-GFP包涵体、天然GFP参比、尿素、1 M Tris-HCl pH8.0、5 M NaCl、1 M DTT、低吸附管、冷室/冰盒、小型搅拌器、15000×g冷冻离心机、兼容尿素的蛋白定量与荧光设备。

05配液与用量

尿素摩尔质量60.06 g/mol；8×0.010×60.06=4.8048 g。蛋白变性液先调至0.5 mg/mL再取100 μL，复性起始蛋白25 μg/mL；低量检测须有足够灵敏度。

06时间安排

07开始前的准备

确认GFP参考波长适用于实际变体，使用同批天然GFP建立可用荧光参比。标记空白、复性样本双管及天然参比。小试不引入通用GSH/GSSG；如实际目标含必须形成的二硫键，本文条件不充分，需另设计。

08逐步操作

1. 记录包涵体来源、湿重10 mg及预洗方法，标清样本、空白、复性管与天然参比。
2. 新鲜配10 mL溶解液，室温溶解尿素后补足体积，测pH并记录温度，不加热助溶。
3. 向10 mg包涵体加入1 mL溶解液，温和吹散，20–25°C转动混合1小时。
4. 检查溶解情况，仍有可见颗粒时继续轻混至2小时；记录而不假定已全溶。
5. 15000×g、4°C离心20分钟，小心转移上清并保存未溶沉淀，记录两相体积。
6. 用尿素兼容方法定量上清，对应溶解液作空白，取一小份SDS-PAGE检查目标比例。
7. 用溶解液把目标为主的上清稀释到0.5 mg/mL总蛋白；若纯度不足，先进行已验证的变性纯化再复性。
8. 每复性管放1900 μL预冷基液；将100 μL变性蛋白分10次、每次10 μL滴入轻混液体中，20–30分钟完成。
9. 空白同样滴加100 μL无蛋白溶解液；天然参比配成相同基质和相近蛋白浓度，记录其尿素暴露时长。
10. 盖好各管，4°C放16–24小时，记录是否变浑浊，不涡旋破坏聚集状态。
11. 各管15000×g、4°C离心20分钟，保留上清与沉淀，量回收体积并测上清蛋白浓度。
12. 用适合GFP变体的相同激发/发射条件测样本、空白和天然参比，扣空白，按相同蛋白质量归一化。
13. 比较可溶回收率与单位蛋白荧光，记录是否达到下一步要求；失败小试不得作为“天然活性蛋白”放行。

09结果判断与质控

可溶回收率=复性上清总蛋白质量/进入复性蛋白质量×100%；纯度变化时该值并不等同目标回收。GFP比荧光相对于天然参比上升才支持荧光恢复，不能由透明液体宣布完全复性。天然参比受尿素影响也应如实报告。

10实验记录模板

11常见问题与排错

滴加立即浑浊：降低进入复性蛋白浓度、放慢滴加或独立筛选缓冲pH；保存失败记录。可溶但无荧光：查GFP变体成熟、尿素及仪器设置，不宣称功能已恢复。溶解失败：检查包涵体纯度与溶解液，不能无限加热或补还原剂。

12参考资料

旧来源：网络手册物理167–168、174–175页；短版12–13页。现代核对：EMBL PEPCF，Protein purification，Insoluble proteins/inclusion bodies小节，查阅2026-11-02；核对洗涤、8 M尿素/6 M盐酸胍、澄清及透析/稀释复性且须目标特异优化。本文以不依赖二硫键的GFP受限小试替代旧文未给复性液组成、直接复性48小时和0.01×PBS冻干的通用表述。