01本篇适用条件
使用合法取得、已固定包埋的普通非感染性小鼠小肠4 μm带电玻片，检测Ki67。明确采用兔抗Ki67 ab15580和抗兔Alexa Fluor488二抗A-11008，荧光IHC而非DAB显色。本例10 mM citrate pH6.0、95–98°C20分钟及一抗1:500是需已在相同固定组织和批次预验证的教学条件，不保证适合所有固定时间、物种或抗体克隆。没有适配记录时先用阳性切片小试，不开始未知样本比较。
02实验原理
修复暴露表位，一抗结合目标，荧光二抗提供空间信号，DAPI显示核。小肠隐窝增殖区作为已知阳性区域，成熟绒毛区域预期较低；分布符合形态只是辅助证据，不能替代抗体特异性验证。
追踪抗原修复后的一抗和二抗结合步骤；原图终点为酶促底物显色，本库Ki67篇使用荧光二抗，仅借此理解上游顺序，显色试剂不可互换。
保留脱蜡复水、热修复、HRP/TSA检测及成像四阶段。原文靶标GD2、TSA放大、修复及检测试剂均不同于本篇Ki67直接荧光二抗体系，原图温度和时间不能移植。
03安全与适用范围
二甲苯和乙醇在通风橱操作、远离热源，热修复防烫且不密封加压非承压容器。组织来源、伦理和固定记录清楚；戴手套、护目镜。荧光染料和DAPI按SDS管理，后段避光。
04材料与仪器
- 小鼠小肠4 μm切片和已知Ki67阳性相邻切片，另备无一抗、无一抗无二抗的未染对照。
- ab15580、A-11008及相同二抗来源的正常山羊血清、10% Triton X-100、PBS。
- 定义为100 mM citrate pH6.0的10×修复液、二甲苯、乙醇、DAPI1 mg/mL储备、抗淬灭封片剂。
- 带温度监测的水浴/蒸汽修复设备、染缸、湿盒、荧光显微镜。
05配液与用量
| 液体 | 配方 | 使用量/终浓度 |
|---|---|---|
| 修复液100 mL | 定义的10×citrate10 mL+水90 mL | 10 mM citrate pH6.0，完全浸没切片 |
| 封闭/抗体稀释液10 mL | 山羊血清500 μL、10%Triton100 μL、PBS9400 μL | 5%血清、0.1%Triton |
| 一抗1 mL | ab15580 2 μL+上述稀释液998 μL | 1:500，每片100 μL |
| 二抗1 mL | A-11008 2 μL+稀释液998 μL | 1:500，每片100 μL |
| DAPI工作液1 mL | 1 mg/mL原液先10 μL+水990 μL得10 μg/mL，再取100 μL+PBS900 μL | 1 μg/mL，每片100 μL |
| 40 mL复水浴 | 无水乙醇40/38/28 mL，各补水至40 mL | 100/95/70% |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 烤片 | 60°C | 1小时 |
| 脱蜡/复水 | 室温 | 约25分钟 |
| 热修复/降温 | 95–98°C/室温 | 20/20分钟 |
| 封闭/一抗 | 室温/4°C湿盒 | 1小时/12–16小时 |
| 二抗/DAPI | 室温避光 | 1小时/5分钟 |
07开始前的准备
为样本、阳性、无一抗、未染对照贴签，记录切片厚度与固定方式。示例组织有效区域≤约2 cm²，100 μL能覆盖；较大片需按面积放大，不让边缘干燥。提前选统一曝光、随机或连续取视野规则及核计数方法，不等看到漂亮图后再选统计区域。
08逐步操作
- 60°C烤片1小时，检查组织完整附着；组织开裂、脱片或来源不明时先暂停。
- 二甲苯每缸40 mL，室温脱蜡5分钟两次；再100%乙醇每次40 mL、3分钟两次。
- 95%和70%乙醇各40 mL、3分钟，随后水40 mL5分钟。复水后全程保持湿润，不让组织直接暴露干燥。
- 把切片完全浸入100 mL已配1×citrate，监测液温达到95–98°C后计20分钟，避免剧烈沸腾和蒸干；不把设备显示温度当作实际液温。
- 离开热源在同一缓冲中自然冷却约20分钟，转PBS洗5分钟两次，确认组织仍完整。
- 用疏水圈笔沿组织外侧画圈，不画到组织上。每片加100 μL封闭液，室温湿盒1小时。
- 轻去封闭液，样本和阳性各加100 μL 1:500 ab15580，无一抗及未染对照加100 μL相同稀释液，4°C湿盒12–16小时。
- 第二天以PBS每次40 mL洗5分钟，共3次；轻摇但不猛烈冲刷，弃液后及时进入下一步。
- 样本、阳性和无一抗片各加100 μL 1:500 A-11008，未染片仅加稀释液；室温避光1小时，湿盒保持液体覆盖。
- 再PBS洗5分钟3次。各片加100 μL、1 μg/mL DAPI室温避光5分钟；若需要评估DAPI以外的绝对自发荧光，可另保留完全无染片。
- PBS洗5分钟两次，轻去周围多余液，各加约25 μL抗淬灭封片剂并盖玻片，避免气泡及组织被压移；按封片剂要求固化。
- 先看未染和无一抗对照设置背景，再检查阳性隐窝核内Ki67是否可见。样本与对照使用相同曝光和激光/增益，不为单个样本随意调亮。
- 预先规定取完整隐窝或连续区域，逐视野记录Ki67阳性核与总有效核，避免将基底膜外背景和碎屑算为核；留全视野和代表形态图。
- 对照失败、信号主要弥散在核外、或组织大片脱落时不报告阳性率。合格切片避光4°C短期保存，复拍记录光漂白及时间。
09结果判断与质控
应看到在有效对照下、与隐窝增殖区一致的核内Ki67信号，无一抗背景较低。荧光强度不是细胞增殖速率，Ki67阳性率也不等于所有细胞的分裂次数；需说明取样区域、分母及判阈。跨批次比较应有共同阳性控制和一致成像条件。
保留两类异种移植组织、放大区域、流式直方图、比例尺及图例。原文注明转载自Fischer-Riepe等，DOI 10.1158/1078-0432.CCR-23-3157；这是GD2阳性/阴性验证，与本篇Ki67不同，不将其对照或阈值当作本篇结果。
完整保留四列组织与对应细胞系流式结果、轴和比例尺，比较表达异质性；其GD2与本篇Ki67靶标不同，组织和培养细胞读数不可简单互换，也不据此设临床评分界值。
保留三种来源各三个组织、原标签及比例尺；表达差异为原文患者样本，不是本篇结果，不能据亮度跨批次比较或推断Ki67增殖比例。
保留A–F全部图及比例尺。原图A/D/E为day 1，B/C/F为day 2；A/C/E/F为operator 1，B/D为operator 2，上下行为不同患者组织。用于理解批间控制，不将视觉相似替代定量精密度或本篇Ki67验证。
保留全部DAB图与比例尺。棕色酶促显色不同于本篇荧光终点，不能将DAB底物和信号放大步骤混入本篇荧光二抗体系，也不以棕色强度直接比较Ki67。
保留两组原标签和比例尺，展示此HRP/TSA体系的内源性过氧化物酶封闭差异；本篇使用荧光二抗，不能由此机械加入H2O2步骤，也不能将原GD2图当作Ki67结果。
完整保留原图。为β-actin靶标及酶促染色例，与本篇Ki67荧光体系不同，不能据此推定Ki67组织定位或抗体浓度。
完整保留原组织图。小鼠肿瘤β-actin与本篇Ki67靶标和荧光终点不同，不能移植原图阳性范围或将其当作本篇动物实验结果。
原文为福尔马林固定石蜡小鼠脾、自动平台、HRP/ABC-DAB与苏木素复染；本篇为荧光二抗体系，固定修复、检测链和终点不同，不照抄原图条件。
原文为PFA固定扁桃体、热修复与生物素二抗的用户贡献图；与本篇荧光体系不同。保留比例尺，单幅阳性图不能证明抗体特异性或本篇已验证条件。
原例为石蜡皮肤癌、高压柠檬酸修复与HRP聚合物-DAB，不同于本篇荧光检测；不能将其修复条件和阳性分布移植至其他组织。
保留未损伤、24 h及48 h三行，以及UHRF1、Ki67和含DAPI合成图三列与比例尺。原文为SO2损伤小鼠气管，来源Xiang et al., Cell Discovery 2017，DOI 10.1038/celldisc.2017.19；不作为本篇条件或仅凭Ki67判定修复机制。
保留0与1 μM全部原图；绿色Ki67、蓝色DAPI，二抗为DyLight 488。原处理、细胞和检测体系与本篇组织不同，视觉信号变化不是增殖率的独立定量或NADA机制证明。
原文为P0小鼠嗅球外层、Alexa Fluor 488二抗的20×共聚焦图；图来自Julien Laffaire。不同组织与通透体系需单独验证，本图不提供通用阈值或本篇组织比例。
保留整幅阳性组织及左下二抗单独处理对照，不切掉控制图。原例为自动平台、HRP-DAB和苏木素，非本篇荧光路径；阴性控制只支持该检测背景，不直接证明所有抗体结合特异。
保留绿色Ki67、红色α-tubulin、蓝色DAPI及合成图全部四panel。图内嵌入试剂编号用于识别前两靶标；这是甲醇固定HeLa、共聚焦最大强度投影例，不能代替本篇石蜡组织固定兼容验证或串色对照。
原用户图为PFA固定、皂苷通透与FITC二抗，显示细胞中Ki67染色；来源Jose Javier Martin De Llano。没有统一分母、阈值与视野采样规则时，不以可见阳性数直接报告增殖百分比。
保留上排野生型、下排敲除以及合成/绿色Ki67两列。基因敲除是有力的应用特异性验证，但该甲醇固定细胞验证不自动覆盖本篇石蜡组织、其他固定方式或全部批次。
原图绿色为Ki67，DNA用DAPI着色为红色；此为63×原协作者图。原作者结合48 h血清饥饿解释为主要G0群体，不能仅凭低Ki67单独证明G0或排除其他低增殖原因。
原用户图采用PFA固定石蜡切片、柠檬酸热修复及Texas Red二抗；与本篇其他荧光体系的光谱和背景不同。保留完整视野，不将阳性亮度或位置当作通用对照。
原例为自动平台、柠檬酸修复、HRP聚合物-DAB与苏木素，保留整幅原图。原文也要求其他平台重新优化，不能把其抗体浓度、修复时间或棕色强度移植为本篇荧光定量。
保留原用户贡献的石蜡小鼠肿瘤全图，来源Jim Manavis；原体系用生物素二抗，与本篇荧光体系不同，不能将其阳性比例或稀释倍数当作现批次结论。
保留完整原图，来源Gabriel Luna。原页面对Ki67颜色先写green、后写red，图注存在不一致；因此仅作不同组织/厚切片示例，不由此确定各通道身份、共定位或细胞计数，也不照搬酸处理等条件。
保留绿色Ki67、红色α-tubulin、蓝色DAPI与合成图四panel；图内嵌入试剂编号用于识别前两靶标。原文为甲醇固定Mef1的单个共聚焦切面，不同于HeLa最大强度投影及本篇组织图，不能横向比较亮度。
完整保留泳道1/2、分子量标尺及全部条带；两泳道分别为HeLa全细胞裂解物、不加与加入Ki67竞争肽。来源原图仅114×223像素，保持原生分辨率；肽竞争不单独证明所有条带特异，WB应用也不能替代本篇组织验证。
原用户图为甲醛固定石蜡人结肠、热修复及HRP/DAB外观，来源匿名AbReview；保留原图，不将示例抗体稀释、局部分布或阳性数当作本篇结果。
10实验记录模板
| 组织/来源/固定 | 厚度 | citrate批次/pH | 实际修复温度/min | 一/二抗批次和倍数 | 阳性/阴性 | 取样核数/阳性核 | 原图及曝光 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 4 μm | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
阳性组织也无信号
查固定、修复、抗体批次、二抗配对及光源，先优化阳性，不把未知判为阴性。
自发荧光高
与未染对照比较，选择适合通道或已验证抑制策略；不以软件减背景替代对照。
组织脱落
查玻片、烤片、沸腾和修复强度；重新优化后重做，不能只分析幸存小块。
12参考资料
- STAR Protocols：FFPE组织免疫荧光方法与抗原依赖性，PMC11321291：已读其修复、对照、湿盒和成像边界；其靶标GD2与本篇不同，未照搬其TSA/Tris-EDTA条件。
- ab15580及A-11008：本文明确另行定义的Ki67教学起始体系，须有同固定组织和现批次的本地适配验证。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。