非感染性IgG ELISpot：已建立杂交瘤的分泌斑点小试

02实验原理

膜上抗IgG捕获附近细胞分泌的IgG，再用生物素抗IgG及链亲和素-ALP/BCIP-NBT形成局部斑点。计数需在可分辨范围；合并斑点、背景与细胞迁移会使斑点数偏离细胞数。

04材料与仪器

鼠IgG分泌杂交瘤、匹配完全培养基与FCS、经验证分泌参比；Mabtech鼠IgG ALP配套捕获抗体0.5 mg/mL、生物素检测抗体0.5 mg/mL、链亲和素ALP、即用BCIP/NBT；MSIP型PVDF96孔板、PBS、无菌水、移液器、培养箱和斑点读板设备。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先做细胞身份与活率检查，确定教学杂交瘤表达的IgG能被配套抗体识别。本篇用总IgG捕获，不含特异抗原，结果不能称抗原特异反应。参比细胞由实验室已有验证条件提供并记录其浓度；若无参比，本次仅为条件探索。

08逐步操作

1. 规划15孔板图，记录三档细胞、无细胞和参比孔；封闭与细胞培养使用相同批次FCS。
2. 向MSIP孔各加15 μL35%乙醇，最多1分钟，立即用每孔200 μL无菌水洗5次。

   

   

3. 每孔加100 μL15 μg/mL捕获抗IgG，4–8°C过夜，盖好防蒸发。

   

4. 次日每孔用200 μL无菌PBS洗5次，充分去除游离捕获抗体及防腐剂。
5. 各孔加200 μL含10%FCS匹配培养基，室温封闭至少30分钟。
6. 计数细胞并记录活率，从1×10⁴活细胞/mL起做两次1:10稀释，每份至少1 mL，轻柔混匀。
7. 去封闭液，各孔加100 μL对应细胞液/空白液/已验证参比，三档分别10/100/1000细胞。

   

8. 37°C、5%CO₂培养16小时，放在水平稳定位置，期间不移动板；记录起止时间。

   

9. 弃细胞液，用200 μL PBS洗5次，去除细胞，避免枪头碰膜及液体流到膜底造成毛细漏液。
10. 各孔加100 μL1 μg/mL生物素抗IgG，室温2小时；再PBS200 μL洗5次。

    

    

11. 加100 μL1:1000链亲和素-ALP，室温1小时；PBS200 μL洗5次，不用Tween。

    

    

12. 加100 μL即用BCIP/NBT，各孔一致起始，10分钟开始观察；出现清楚独立斑点时立即大量水洗终止，通常10–30分钟。

    

13. 取下适配底托，按板型许可冲洗膜底，室温避光彻底干燥后读板；湿板背景不能直接作为最终结果。

    

14. 同一检测阈值计所有孔，标记融合/饱和孔，报告原始斑点、空白及细胞梯度；选可分辨密度再做独立重复验证。

    

09结果判断与质控

无细胞孔应低背景，参比出现独立斑点。斑点密集融合的孔不可硬算，记录“超可计数范围”；杂交瘤并非每个细胞都只形成一个点。SFC/10⁶活细胞=(样本斑点均值−空白均值)/实际播种活细胞数×10⁶，仅在可分辨范围作教学近似归一化，原始样本/空白斑点必须另列；不能用简单扣背景后的值判定免疫阳性或诊断。

10实验记录模板

11常见问题与排错

无斑点：检查细胞分泌、IgG亚型识别及ALP活性，参比同阴性则试剂/操作优先。全膜变黑：缩短显色并检查清洗，不能只修改软件阈值。斑点拖尾：查移动板与细胞迁移，降低密度并保持静置。

12参考资料

旧来源：网络手册物理214页；短版21页。现代核对：Mabtech，ELISpot Flex: Mouse IgG (ALP)，2025-02-27版，第4–7页，查阅2026-11-02。采用Protocol I/II共同的总IgG捕获15 μg/mL、检测1 μg/mL2小时、ALP1:1000 1小时、16–24小时培养和型号限定PVDF活化；用已建立杂交瘤小试替换旧脾细胞获取，10–1000/孔属于探索梯度，非厂家脾细胞推荐密度。