EdU 增殖成像：10µM脉冲、Click反应与阳性核计数

02实验原理

未加EdU但进行全套Click反应的孔是背景对照；正常增殖、加EdU孔为阳性参照。比较组必须有相同脉冲时间与总培养体积。Click为铜催化反应，使用本套试剂次序，不与其他品牌无铜配方拼用；结果以每个独立样本的EdU阳性核/总核计算。

04材料与仪器

C10337完整试剂；HeLa悬液；24孔板与12mm圆盖玻片；商业甲醛固定液、Triton X-100、BSA、PBS；荧光显微镜绿色与蓝色通道；抗淬灭封片剂和载玻片。

05配液与用量

Click表为厂家名义500µL配方按4倍放大；实际加和2004.8µL，不能写成精确2000µL。反应缓冲液按10×稀释1:10；Alexa管加70µL DMSO复溶；添加剂管按说明加2mL水为10×，临用再1:10，不把10×直接加入反应。

06时间安排

07开始前的准备

选择未过密且状态一致的单层，教学起始约40%–70%汇合；预先固定每片5个不重叠视野，目标每样本至少数500个完整核。无EdU孔加入等体积、同载体培养基。根据手册配好1×反应缓冲液和添加剂，Click现配后15分钟内使用。

08逐步操作

1. 无菌放置盖玻片，每孔铺500µL、6×10⁴活细胞/mL悬液，即3×10⁴活细胞，37°C/5%CO₂过夜贴壁。
2. 检查盖玻片平放、细胞分布均匀且未过密，拍照；异常孔先记录，不等待数据出来再删。
3. 预温20µM 2×EdU液，向原有500µL培养液中加入500µL，终体积1mL、EdU10µM；无EdU孔加入对应载体液。
4. 37°C、5%CO₂孵育2小时，记录首末孔加液时间；各组脉冲时长一致，不把长时间累积标记与短脉冲结果混比。
5. 吸去培养液，每孔加入1mL3.7%甲醛/PBS，室温固定15分钟。使用已知浓度商业液配制，不能把37%原液直接加入细胞。
6. 吸去固定液，每孔用1mL3%BSA/PBS洗2次，再加1mL0.5%Triton X-100/PBS，室温透化20分钟。
7. 去透化液，再用1mL3%BSA/PBS洗2次。依配方次序现配Click液：缓冲液、CuSO₄、Alexa叠氮液，最后加1×添加剂，轻混。
8. 每片加入500µL Click液并确保盖玻片表面被覆盖，室温避光30分钟，不让样品变干。
9. 去反应液，用1mL3%BSA/PBS洗一次，再用PBS洗一次；每孔加1mL5µg/mL Hoechst，室温避光30分钟。
10. PBS洗净后将盖玻片细胞面向下用抗淬灭剂封片，固定相机曝光，拍蓝色总核与绿色EdU两通道。

    

11. 用无EdU孔预先确定绿色阳性阈值，排除碎核与重叠难分核，每片数5个预设视野且合计至少500核。
12. EdU阳性率=绿色阳性完整核数÷总完整核数×100%；每样本先汇总再比较独立批次，保存原图、阈值与计数表。

09结果判断与质控

500个完整核中180个EdU阳性，阳性率36%。这表示2小时脉冲内有DNA合成的核占比；DNA修复、周期变化与损伤也可能影响标记。不能将多个视野当多次独立实验，也不能只比较绿色总亮度而忽略细胞数。

10实验记录模板

11常见问题与排错

绿色全无：查添加剂是否临用稀释、配液次序与细胞是否过密。无EdU背景高：检查洗涤、曝光和阈值，不能按组单独改阈值。阳性极高：先查脉冲时长和是否把胞质背景计入核，不直接宣称所有细胞都加速增殖。

12参考资料

• Invitrogen：Click-iT EdU Imaging Kits C10337–C10340官方手册，已读取10mM/10µM、固定15分钟、0.5%Triton20分钟、Click配方次序及30分钟反应。
• ATCC：HeLa CCL-2。12mm盖玻片、铺板数、2小时脉冲和计数目标为教学设置。