01本篇适用条件
筛查8个明确BSL1 K-12衍生DH5α教学克隆，载体两侧引物对在空载体扩增200 bp、含800 bp无害插入时扩增1000 bp。每个菌落单独水悬液取1 μL；另设已确认阳性菌落P、空载体菌落E及水NTC，共11管。不能用本法证明插入方向或每个碱基无误。
02实验原理
少量细菌在初始加热时释放质粒作模板；过量菌体会抑制反应。载体两侧引物同时显示空载体与插入大小，测序再确认接头及序列。蓝白斑只作挑选线索，不作为最终正确性证据。
原图完整保留PCR循环与扩增示意。它用于理解分子过程；本篇温度、时间与循环次数以已限定Taq和模板的正文程序为准。
03安全与适用范围
样本仅为已知无害教学DNA或明确的非致病实验室株。戴实验服、手套，使用过滤枪头；配液、加模板和开扩增管用分开的器材与区域，扩增管只在产物区打开。凝胶和核酸染料按本地SDS处理；优先蓝光成像，断电后开电泳槽。扩增阳性不代表序列正确。
04材料与仪器
- 新鲜独立DH5α教学菌落8个，已验证阳性和空载体菌落，匹配选择标记的复制平板。
- 10 μM载体两侧引物、GoTaq G2及Colorless缓冲液、dNTP、水、一次性挑菌头。
- 热盖PCR仪、1.5%胶、100 bp梯、蓝光成像。
利用箭头辨认电极、胶槽与制胶组件，再按正文核对上样孔朝负极以及DNA迁移方向。图中设备仅为结构示例，不能照搬电源旋钮、尺寸或电压。来源为Addgene技术教程局部图，非商业推广。
05配液与用量
| 每25 μL反应 | 加量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 5×Colorless GoTaq反应缓冲液 | 5 μL | 1×；MgCl₂ 1.5 mM，不再盲加镁 |
| dNTP，四种各10 mM | 0.5 μL | 每种0.2 mM |
| 正向引物10 μM | 0.5 μL | 0.2 μM |
| 反向引物10 μM | 0.5 μL | 0.2 μM |
| GoTaq G2，5 U/μL | 0.125 μL | 0.625 U；用总混液避免单管吸0.125 μL |
| 模板或水 | 1 μL | 见正文指定 |
| 无核酸酶水 | 17.375 μL | 总25 μL |
100 μM引物工作液以10 μL储备加90 μL水配成10 μM。N管共用混液按N×1.1份配，模板不加入混液；每管分24 μL再加1 μL模板/水。
11管按12.1份配：5×液60.5 μL、dNTP6.05 μL、F/R各6.05 μL、酶1.5125 μL、水210.2375 μL，共290.4 μL；可按仪器精度0.01 μL四舍五入，以总量核对。每菌落悬于20 μL水，仅取1 μL入反应。
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 挑菌/复制/配液 | 洁净操作 | 30分钟 |
| PCR | 95°C5分钟；30循环95°C30秒/58°C30秒/72°C60秒；72°C5分钟 | 约90分钟 |
| 电泳 | 1.5%胶、5 V/cm | 30–40分钟 |
| 复制平板 | 37°C | 12–16小时 |
07开始前的准备
先用纯化已知质粒验证该引物在58°C有预期200/1000 bp带。打印八格复制板图；旧菌落必须空间分离，接近融合的区域重新划线。示例选择标记为AmpR时使用含100 μg/mL氨苄青霉素LB板，不能把其他抗性克隆放该板。
观察枪头与胶孔的位置；正文上样时避免戳破胶底、漏到缓冲液或挤入相邻孔。照片是原教程示例，不代表本篇样本、上样量或实验结果。来源为Addgene技术教程，非商业推广。
原图全部三类引物策略及正负模板保留。载体两侧引物筛查插入大小，载体加插入引物可检验方向；示意图的片段长度不是本文规定的200/1000 bp或亚克隆430 bp，具体预期由本篇图谱和引物位置计算。
08逐步操作
- 标记菌落C1–C8及P、E，拍摄原平板，把位置对应到记录表和复制板图。
- 在冰上准备十支20 μL水悬液管，另备NTC水，逐管使用新枪头。
- 用枪头轻触C1菌落一点，先在对应复制板格划短线，再在C1水中涮洗；同样处理其余与P/E。
- 封好复制板，37°C倒置培养12–16小时保存对应活克隆；不要把PCR中残液重新当作保种。
Addgene原流程图完整保留设计引物、建立PCR反应、分析PCR产物三个阶段及箭头、反应组分和凝胶示意。本篇先复制保种，再取少量DH5α水悬液进入25 μL体系；图不是本批实验记录，也不替代正文对照。
Addgene，Plasmids 101: Colony PCR，Beth Kenkel，2016，网页原始完整图来源机构版权；公开技术资料完整图教学引用，未声明开放许可；不含商品推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 配12.1份不含模板的混液，按表核对总量290.4 μL，每个PCR管分24 μL。
- 先给NTC加1 μL水并封管，再按C1–C8、E、P顺序各加1 μL对应悬液，盖紧换头。
- 短离心5秒收液，确认无液滴挂盖与漏盖，写明引物编号及批次。
- 设置95°C5分钟；30循环95°C30秒、58°C30秒、72°C60秒；72°C5分钟，4°C暂存。
- 在产物区每管取5 μL加1 μL6×上样液，按板图上1.5%胶，加入100 bp梯。
- 以5 V/cm电泳到200与1000 bp可分清；断电后成像，保存完整图和泳道表。
原图全部三组泳道、阳性/阴性标签与预期带型完整保留，属于示意图，不是本实验实测胶。本文P为1000 bp、空载体E为200 bp、NTC应无目标带；三类引物的阴性表现不同，不能把任何无带都判为靶标缺失。
Addgene，Plasmids 101: Colony PCR，Beth Kenkel，2016，网页原始完整图来源机构版权；公开技术资料完整图教学引用，未声明开放许可；不含商品推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 选只有约1000 bp带的2–3个克隆，回到复制板核对编号，分别接种匹配选择培养液用于后续质粒验证。
- 对候选质粒进行接头与全插入Sanger测序，方向另用测序或方向性PCR确认；无结果者保留待定。
- 记录每克隆带型、保种格、后续样本编号，培养物和耗材按BSL1流程处置。
09结果判断与质控
P约1000 bp、E约200 bp、NTC无带且克隆约1000 bp为初筛阳性；同时200/1000 bp可能是混菌，重新分离单菌落。单一1000 bp也不能排除点突变或错向。
10实验记录模板
| 克隆/原位置 | 复制板格 | 悬液状态 | PCR泳道 | 200/1000 bp/其他 | 对照有效 | 后续质粒/测序编号 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| C1–C8/P/E/N | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
无带而P正常
模板菌太多/释放不足，悬液1:10稀释后取1 μL复测；仍无带再用纯化DNA。
两种大小
优先排查混菌，重新划单菌落后复测。
所有管相同
检查NTC污染、引物配对和泳道错位，不直接宣称全部阳性。
12参考资料
- 用户提供网络手册物理第29–30页：读取菌落PCR及多种相互冲突补充，澄清储备浓度、缓冲含镁及“可以省阴性对照”。
- Addgene，Plasmids 101: Colony PCR，全文查阅2026-11-02：核对三类引物、少量水悬菌、先保种、空载体及阳性/NTC、最终测序。
- Promega，GoTaq G2 DNA Polymerase Product Information，9PIM784，修订03/18：已读50 μL体系、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM各dNTP、0.1–1 μM引物、约1分钟/kb延伸及25–30循环；本文按体积减半，保留相同酶浓度。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。