大肠杆菌化学感受态制备与热激转化：50 mL DH5α教学批次

02实验原理

低温二价阳离子处理使细胞适于摄取质粒，短暂热激后需无抗生素复苏以表达抗性。培养期、细胞状态与DNA形式影响效率；连接反应的菌落数不能与等质量完整质粒直接比较。

04材料与仪器

• 新鲜DH5α单菌落、LB、无菌0.1 M CaCl₂、SOC、Amp储备液100 mg/mL、LB琼脂平板。
• 冰盒、250 mL摇瓶、冷冻离心机与适配50 mL管、37°C摇床、42°C水浴、分光光度计、无菌涂布器。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先标记样本S、阳性P、无DNA N。水浴用独立温度计确认42°C；CaCl₂、离心管与转子预冷。用LB做OD600空白，浑浊样品先稀释后回算。自制细胞批次须以同一已知质粒做阳性质量检查；禁止把“洁净即可、无菌无所谓”当成操作要求。

08逐步操作

1. 挑单菌落入3 mL LB，37°C充分振荡培养过夜；记录菌株和菌落来源。
2. 取0.5 mL种子加入49.5 mL LB，在250 mL摇瓶37°C培养；每30分钟测OD600，达到0.4–0.6即停止。
3. 培养物冰上冷却15分钟；4°C、2500×g离心10分钟，吸去上清，保持细胞在冰上。
4. 用20 mL冰冷0.1 M CaCl₂轻轻重悬沉淀，避免涡旋和泡沫；冰上静置30分钟。
5. 4°C、2500×g离心10分钟，弃上清；以2 mL冰冷0.1 M CaCl₂轻轻重悬，冰上放30分钟，当天使用。
6. 三管各分装50 μL细胞；S加1 μL 10 ng/μL质粒，P加1 μL 1 ng/μL完整质粒，N加1 μL无菌水，轻弹混匀。
7. 三管冰上30分钟；平板放至室温、表面无游离水，提前写明样本和抗性。
8. 依次将管底浸入42°C水浴，45秒后立即转冰上2分钟，每管独立计时。
9. 各管加入450 μL不含抗生素的SOC，轻轻混匀，37°C振荡复苏45分钟。
10. P管取10 μL复苏液加990 μL SOC配成1:100稀释；另取原液留作回查。
11. S分别涂50及100 μL，N涂100 μL，P稀释液涂100 μL于各自Amp板；轻推至吸收，勿反复刮伤琼脂。
12. 平板倒置37°C培养16–20小时；记录独立菌落，避免把卫星小点记为转化子。
13. 若P板可计数，效率=菌落数×501/100×100/0.001 CFU/μg；同时报告稀释和涂板体积，不能只给效率数字。
14. 挑S的独立菌落进一步PCR/酶切和测序确认；登记该批自制细胞表现，废弃剩余当天感受态与培养废物。

09结果判断与质控

无DNA板应无菌落，阳性板应有独立菌落。阳性失败使本批样本阴性不可解释；阴性长菌先查污染或平板抗生素失效。自制CaCl₂的离心/洗涤是本例教学设置，效率须实测，不能承诺达到10⁸ CFU/μg。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

全部无菌落

检查P是否生长、抗性是否匹配、42°C水浴及复苏条件；先重做质控。

阴性长菌

检查无菌操作、平板选择性和交叉加样。

菌落密集或卫星多

降低涂板量并缩短培养至独立菌落可辨时，挑大而隔离的主菌落。

12参考资料

• 旧《分子生物学实验手册》物理第65–67页及短版物理第9–10页：CaCl₂制备与热激线索，纠正相互矛盾的离心单位与“无需无菌”说法。
• Addgene，Bacterial Transformation，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：已读20–50 μL细胞、冰20–30分钟、42°C30–60秒、冰2分钟、250–1000 μL复苏与45分钟培养；本例取固定参数，CaCl₂制备属于旧法限定教学批次。