DpnI定点突变：4 kb无害教学质粒的全质粒扩增与测序

02实验原理

含突变引物扩增产生未甲基化新DNA，DpnI优先切甲基化亲本，转化后获得候选。残留亲本同样可形成菌落，因此抗性和预期酶切只作筛选；最终要测序功能关键区，不能推定所有PCR产物都是完美缺口圆环。

04材料与仪器

• dam⁺提取质粒10 ng/μL；已核互补引物各25 μM；Pfu2.5 U/μL与配套10×缓冲液；dNTP各10 mM；DpnI10 U/μL；合格DH5α化学感受态。
• PCR仪、移液器、冰盒、42°C水浴、选择平板、凝胶与测序。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

引物把突变放中间、两侧有足够匹配序列，避免强二聚体；先验证退火温度适于本Pfu方案的55°C设置。核对模板不是dam⁻菌株来源。DpnI在所用Pfu缓冲液中兼容性须由该酶技术信息或预实验确认，不使用无依据热灭活；本路线直接取少量消化液转化。

08逐步操作

1. 保存亲本质粒原始图谱及序列，记录目标碱基、突变后密码子和预计功能变化。
2. 按量稀释模板及引物，标记S、无引物背景B和无模板扩增N；各用独立枪头。
3. 在冰上先加水、buffer、dNTP、引物和模板，最后加Pfu，按表配成50 μL，轻混短暂收液。
4. PCR设95°C30秒；18循环95°C30秒、55°C1分钟、68°C8分钟，4°C暂存；4 kb×2分钟/kb=8分钟。
5. 取S、B、N各3 μL检查扩增与污染，S/B各余47 μL继续处理；产物不明显时不要无限增加循环。
6. S/B各将剩余47 μL加入1 μL DpnI，即各加10 U DpnI，37°C1小时；记录酶标示浓度与兼容依据。
7. 将50 μL感受态在冰上融化；S/B各加2 μL消化液，阳性另加1 ng已知质粒，无DNA对照加水。
8. 冰上30分钟，42°C热激45秒，迅速冰上2分钟；加450 μL SOC，37°C振荡45分钟。
9. 各组取50及100 μL涂对应抗性板，37°C倒置16–20小时；记录S与B的总背景。
10. 从S挑6–8个分离菌落，先在主板保留，再各接3 mL抗性LB过夜。
11. 小提定量，用设计的新/失去限制位点筛查；若没有诊断性位点可直接送测，不编造酶切区别。
12. 对候选至少测覆盖目标位点两侧的双向序列，同时检查完整插入及其他功能关键区域。
13. 检查峰图是否混峰、是否出现引物重复或多余突变；正确突变且关键区无异常才定最终克隆。
14. 保存亲本、正确突变株、图谱与全套序列；若B接近S菌落数，先优化亲本消化/模板量再开展功能比较。

09结果判断与质控

无模板扩增无污染、转化阳性有效、S相对B有可解释候选后再看测序。背景不为零不代表必然失败，但每个最终克隆都必须证实预定突变和关键区序列；PCR增幅和DpnI处理不能代替序列确认。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

仅亲本序列

检查甲基化状态、DpnI活性及模板过多。

无候选

查引物二聚体、质粒长度和Pfu体系；不能直接改用另一酶却保留原退火程序。

多个非预期改变

换独立候选并检查序列，必要时重新扩增，不能选择性忽略功能区变异。

12参考资料

• 旧网络手册物理第78–79页：经典Pfu50 μL、18循环、68°C2分钟/kb及DpnI10 U37°C1小时；本文保留路线但限定4 kb。
• Addgene，Site Directed Mutagenesis by PCR，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：已读dam⁺亲本、DpnI甲基化依赖、高保真聚合酶、引物重复和功能区测序要求；该技术文不验证任意Pfu/DpnI组合的缓冲液兼容性，须记录本地验证。