DIG-LNA固定切片RNA原位杂交：显色与竞争对照

02实验原理

DIG-LNA与固定切片中的互补短RNA结合，再用anti-DIG-AP和NBT/BCIP形成局部不溶显色。竞争探针与无探针对照用于识别非特异背景；染色位置反映可检出的靶序列分布，不能单凭颜色强弱判定绝对拷贝数。

04材料与仪器

• 同一批预固定10 μm切片，至少样本、已知阳性、无探针和100倍未标记同序列竞争各一张；经纯化DIG-LNA与未标记同序列探针。
• 4%多聚甲醛/PBS、PBS、Biochain IsHyb即用杂交液、SSC、1×封闭液、anti-DIG-AP、1×AP缓冲液（100 mM Tris pH9.5、100 mM NaCl、50 mM MgCl₂）、NBT和BCIP储备液、RNase-free水、水性封片液。
• 防脱载玻片、湿盒、温控孵育箱、疏水笔、明场显微镜；切片来源与前处理须有记录。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

确认切片初始固定方式、厚度和探针Tm；先在已知阳性材料验证该LNA，再处理实验片。每张切片约1 cm²，湿盒中加无RNase水防蒸发但不浸片。全部组使用相同25 μL杂交体积、同批显色和同一终止时点。旧手册不一致的预杂交总体积不沿用。

08逐步操作

1. 核对切片编号与来源，室温平衡后50°C干片15分钟，使用疏水笔围住约1 cm²区域，勿划伤切片。
2. 加入4%PFA覆盖切片，室温20分钟后在PBS洗三次各5分钟。
3. 吸走切片周围液体但不使组织变干，加50 μL即用IsHyb，湿盒60°C预杂交3小时。
4. 按表配普通DIG、100倍竞争和无探针各25 μL；阳性片使用同一DIG探针液，不能另换高浓度。
5. 将含探针液65°C5分钟，短暂冰冷；去预杂交液，分别加对应25 μL，盖无RNase盖片排泡。
6. 放55°C湿盒12小时；检查湿盒密封，蒸发导致边缘浓缩的切片单独标记。
7. 以预温2×SSC轻柔释放盖片，55°C2×SSC洗10分钟，再55°C1×SSC洗10分钟。
8. 37°C0.2×SSC洗两次各20分钟；换液沿玻片边缘加入，勿用液柱直接冲组织。
9. 加50 μL1×封闭液，室温湿盒封闭1小时；同时以2+998 μL配1:500 anti-DIG-AP。
10. 各片加50 μL抗体液，4°C湿盒孵育过夜，无探针及竞争片也同样加抗体。
11. PBS洗三次各10分钟，再用1×AP缓冲液洗两次各5分钟；准备明场显微镜与显色计时表。
12. 现配NBT/BCIP工作液，每片加50–100 μL完全覆盖，室温避光；每15–30分钟在相同条件观察P和无探针片。
13. 当P出现清晰定位而无探针片背景仍低时，所有组同时用水充分洗涤终止，记录实际显色时间；不得让无探针片也全面着色。
14. 水性封片，避免酒精脱水/二甲苯使本路线显色和组织状态改变；同倍率同照明拍全片及代表区域。
15. 比较有探针、100倍竞争、无探针和已知P；竞争应明显降低特异定位，未降低时先排查非特异结合或对照设计。
16. 保留未处理原图、取景位置和所有阴性结果；跨样本比较需同批处理和盲法取景，不单靠挑选最深色区域。

09结果判断与质控

P定位明确、无探针低背景且同序列竞争显著降低信号才支持特异检测。LNA与旧长RNA探针的渗透/温度不同，旧图可示范定位但不能证明本批探针有效；本法不提供临床诊断结论。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

全片背景深

检查无探针、内源性AP、抗体残留和显色过久；先缩短显色并改善洗涤，不能只调照片亮度。

切片脱落

查载玻片、固定与液流；不强冲、不让干湿反复。

P也无信号

检查RNA保存、LNA标记/序列、温度和检测链，不把样本阴性当成真实无表达。

12参考资料

• 旧网络手册物理第95–111页：DIG RNA原位原理、探针点检与组织定位；第96页灌流图不纳入，旧预杂交总体积错误不沿用。
• Song、Ro与Yan，In situ hybridization detection of microRNAs，Methods in Molecular Biology，2010，PMC3062509，查阅2026-11-02：已读完整固定切片LNA流程，核对PFA20分钟、60°C预杂交3小时、55°C杂交12小时、分级SSC、1:500抗体与NBT/BCIP。正文将小体积配方统一为25 μL，固定为同剂量100倍竞争；这是等量体积调整，需阳性片验证。