DCFH-DA 类细胞ROS：探针加载、过氧化氢控制与归一化

02实验原理

短时控制采用先加载30分钟，再H₂O₂处理30分钟；长于2小时的研究处理需按说明考虑先处理后加载，不能混为同一时程。每条件配有探针与无探针孔，并设无细胞探针背景、载体基线和阳性候选。数据需结合细胞数、活率和自发荧光，不能只看绿色变亮。

04材料与仪器

R252探针与10×Loading Buffer；HBSS、纯水、EMEM完全培养基；HeLa；黑色透明底96孔板；有浓度复核记录的100mM H₂O₂工作储备液；488nm激发、绿色收集的读板仪或显微镜；平行细胞计数材料。

05配液与用量

H₂O₂两级稀释共1000倍，配制后立即使用，不将“100mM储备液”误当100µM直接加孔。阳性100µM/30分钟参照厂家HeLa使用例，是否造成过度死亡仍需本室检查。

06时间安排

07开始前的准备

先做每孔2500、5000、10000细胞预试，选探针信号未饱和、细胞量可比的范围。每条件至少3技术孔，平行板或成像记录活细胞数，不能用同一孔CCK-8反应后再测ROS。读板滤片按R252说明选择，如Ex488/Em525nm；所有样本固定增益。

08逐步操作

1. 计数后配5×10⁴活细胞/mL悬液，每孔100µL，即5000活细胞，37°C、5%CO₂培养约24小时。
2. 检查细胞已贴壁且密度一致，预设载体、有探针阳性、无探针同处理及无细胞背景孔，写板图。
3. 去培养液，每孔沿壁加100µL HBSS轻洗并吸去，重复2次，不冲落细胞。
4. 现将R252探针按1:1000加入已配1×Loading Buffer，给待染孔各加100µL；无探针孔加100µL缓冲液。
5. 37°C、5%CO₂避光孵育30分钟，各孔加载时间一致，不长时间放在室温。
6. 去加载液，HBSS100µL洗2次，减少胞外游离探针和残余背景。
7. 阳性候选孔加入100µL新鲜100µM H₂O₂/HBSS，匹配基线孔加100µL HBSS，继续37°C30分钟。
8. 终点检查形态和明显死亡，吸去处理液，用100µL HBSS洗2次，再加入100µL HBSS供检测。
9. 立即以固定Ex488/Em约525nm读取，或用同曝光拍绿色和明场；避免反复强光照射造成光氧化。

   

10. 扣除对应无细胞和无探针背景，保持背景定义一致；若研究化合物有自发荧光，必须单列该处理的无探针孔。
11. 用平行样本或可靠核计数记录活细胞量，按每1000个活细胞净信号或单细胞强度汇总，不能把细胞变少后的总荧光下降直接解释为ROS下降。
12. 保存原始孔值、细胞数、背景和时程，至少用独立批次复核；提出特定ROS机制时需其他更有针对性的证据。检测顺序要与加载顺序对应，记录首末孔时间差；若整板无法及时读完，减少同批孔数而非延长最后几孔的孵育。

09结果判断与质控

例：基线净荧光1000、活细胞5000，对应200单位/1000活细胞；处理净荧光1200、活细胞3000，对应400单位/1000活细胞。总信号仅升20%，按细胞量校正后为2倍，两个指标都应保留。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全孔高背景：查探针现配、洗涤、血清残留及读板增益。阳性不升：核对H₂O₂新鲜度、加载与温度。强信号同时大量死亡：该窗口不可单独解释ROS变化，降低或缩短候选条件重新验证。

12参考资料

• Dojindo：R252官方说明书，已读取10×缓冲液、1:1000探针、加载30分钟、两次HBSS洗涤与HeLa100µM H₂O₂/30分钟示例。
• ATCC：HeLa CCL-2。铺板5000细胞及归一化算法为教学设置；改进探针不等同普通DCFH-DA原粉。