考马斯凝胶染色：水基G-250小胶染色与背景清洗

02实验原理

G-250与胶中蛋白结合而显蓝色。电泳缓冲盐和SDS会干扰染料结合，水洗与清背景决定可解释性。条带深浅反映该染色条件下的响应，总蛋白谱不能证明某个蛋白的身份；不同蛋白不应直接按同一灰度换算绝对质量。

04材料与仪器

• 一块约8×8 cm、1.0 mm厚的已跑完小胶，包含蛋白Marker、已知BSA和空白泳道；另留一份同胶同批样本原始记录。
• SimplyBlue SafeStain即用染液20 mL、去离子水至少600 mL、不吸附染料的洁净有盖盒。
• 低速摇床、宽刮片、塑料镊子、白光成像仪、无粉手套与计时器。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

从电泳记录取得泳道图，确认BSA对照已在电泳前上样。若现有胶没有对照，可作探索性染色并如实标记，不能宣称完整质控。染色盒应让整块胶平躺且自由移动；标胶的方向用切角或泳道图，不把预染Marker颜色误当总蛋白染色成功。准备同一曝光条件，防止拍照过曝。

08逐步操作

1. 记录胶类型、厚度、样本身份和电泳结束时间，核对泳道图中BSA两种上样量与空白位置。
2. 电泳设备断电并拔线后才拆胶；用宽刮片把胶移入洁净盒，保持方向，不用镊子夹胶中央。
3. 加100 mL去离子水，使胶完全浸没并展开；低速轻摇5分钟，胶应缓慢自由移动。
4. 弃去第一轮洗水，再用新鲜100 mL水各洗5分钟，共3次，每次换水。
5. 最后一轮洗后沿盒角倒去水，扶住胶边避免滑落；不将胶吹干，不用纸直接擦胶面。
6. 加20 mL指定即用G-250染液，确认整块胶浸没；盖好并室温低速轻摇1小时。
7. 记录染色起止时间；条带提前出现仍按本流程染满1小时，不凭颜色无限延长到过夜。
8. 1小时后把染液倒入指定废液容器，不复用染液；沿盒角缓慢加100 mL去离子水。
9. 室温轻摇清背景1小时，查看白光下BSA和样本条带；背景仍深时继续至最多本轮3小时，并记录实际时间。
10. 弃去第一轮清背景水，换100 mL新鲜水再轻摇1小时，得到较清晰摄影背景。
11. 把胶平铺在白光成像托盘，排除胶下气泡；选择不过曝条件，包含Marker、空白和全部样本拍摄完整胶。
12. 保存原始全胶图和曝光设置；比较同源两种上样量，出现饱和条带时降低曝光，不能用已饱和图定量。
13. 当天需要复拍时将胶浸在水中加盖保存，尽量当天完成；长期水存会降低灵敏度，不给出未经验证的长期稳定保证。
14. 记录条带、背景、破胶和任何补洗，按规定处理凝胶和液体，清洁染色盒并签名。

09结果判断与质控

合格图中应能辨认Marker与BSA，空白无与样本一致的条带；背景平整，所有样本完整显示。未见低丰度蛋白可能只是低于染色检测能力，不等于不存在。对样本全泳道强度的比较还须控制上样、成像线性和分离范围，不能把单条深带等同“高纯度已证实”。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全胶深蓝

先查预洗是否充分、胶厚和盒中运动；按本方案延长清背景，不能把深背景当蛋白过量的唯一证据。

BSA也没有信号

查是否漏上样、染液是否拿错或过期、胶是否泡在染液中；预染Marker正常不能代替BSA染色对照。

胶卷曲、破裂

使用更大盒与宽托片，降低摇速，避免夹中央；保存受损全图并标注不用于定量的区域。

12参考资料

• 用户提供《分子生物学实验方法 老文档 仅供参考》PDF物理第44页：考马斯及胶体G-250的历史方法；不采用旧版0.5% G/R混写及甲醇体系。
• Thermo Fisher Scientific，SimplyBlue SafeStain User Guide，修订4.0，物理第1–2页，查阅日期2026-11-02：核对100 mL水洗3×5分钟、20 mL染1小时、水洗1–3小时与第二轮1小时及不复用染液。