克隆形成实验：每孔200个单细胞到铺板效率和存活分数

02实验原理

克隆形成反映细胞长成集落的长期能力，短时膜完整性正常并不保证形成集落。每组至少3个技术孔，分装前保持单细胞与均匀混合；终点以能可靠计数且未大面积融合为准。阈值可预定为一个连续集落含≥50个细胞，各组一致，不能看到结果后改变阈值。

04材料与仪器

健康HeLa单细胞液；6孔板；EMEM、FBS、PBS；商业4%甲醛固定液；Sigma结晶紫C0775、纯水；移液器和计数板；明场镜及整孔成像设备，带比例尺的计数软件或透明网格。

05配液与用量

两次都是100倍稀释，总1万倍；1×10⁶÷10⁴=100/mL。第一次若实际活浓度不是1×10⁶/mL，先重新计算，不能沿用标签直接分装。

06时间安排

07开始前的准备

首次先确定空白培养对照、基线铺板效率和终止日。研究处理组接种数可根据预试适当提高以取得可数集落，但必须逐组记录真实活细胞接种数；各组不能仅按相同体积计算。准备0细胞培养基空白以识别染料颗粒和污染。

08逐步操作

1. 检查起始HeLa状态和污染检测，温和收获成单细胞，取独立样本计活浓度与活率，记录当前代次。
2. 先以10µL原液加990µL完全培养基配第一稀释液，轻柔混匀，不能依靠摇板完成管内混匀。
3. 从第一液取100µL加9900µL培养基，配10mL、100活细胞/mL悬液；每一步换枪头并记录倍数。
4. 给3个技术孔各加2mL，分每孔前重新轻混母液；另留一个无细胞空白孔加2mL培养基。
5. 水平前后左右平移板，37°C、5%CO₂培养；首次数小时避免频繁取出，防止细胞聚到边缘。
6. 18–24小时显微检查是否主要为分散单细胞或小簇，保存图像；大团块起始的孔不能作为单细胞克隆形成例。
7. 第4天从远离集落的一侧缓慢吸液，沿壁加入2mL预温完全培养基；第7、10天同法换液，不用PBS反复冲洗。
8. 每次记录集落大小、是否融合及污染。按预试确定统一终点，在约10–14天、≥50细胞集落可辨且未大量融合时结束，不给处理组无限延长生长。
9. 吸去培养基，沿壁用PBS1mL轻洗一次，加商业4%甲醛1mL，室温固定15分钟，再温和洗去固定液。
10. 加1mL0.5%结晶紫，室温20分钟；温和洗至背景清楚，倒置晾干，不能用纸擦底面细胞。
11. 拍整孔图，按预设≥50细胞阈值计集落，融合边界不清的区域标记，必要时用高倍核对，保留原图和圈选。
12. 计算PE=集落数÷接种活细胞数×100%；处理组SF=处理集落数÷(接种活细胞数×对照PE小数)。技术孔先汇总，独立批次再作统计。

09结果判断与质控

对照每孔接种200个活细胞、形成160个集落，则PE=80%。处理后仍接种200个、形成80个集落，SF=80÷(200×0.80)=0.50，即50%。把处理集落数简单除以200得40%是未校正铺板效率的比例，不能与SF混称。

10实验记录模板

11常见问题与排错

集落融合：下次减少接种数或提前终止，不能把融合块随意拆成多个。对照PE低：查起始细胞损伤、团聚、低密度支持性和换液冲击。污染：该孔如实记录并按预设规则排除，不用抗生素压住后继续当正常克隆培养。

12参考资料

• ATCC：HeLa CCL-2，已核对该株培养配方与条件。
• ATCC：Animal Cell Culture Guide，已读取细胞计数、低密度接种与生长状态原则。
• 本文六孔板200细胞、10–14天、≥50细胞集落与固定染色量为明确教学方案，需用本株预试验证，不是ATCC给出的克隆形成性能保证。