Co-IP：普通细胞β-catenin复合物的对照式富集

02实验原理

Co-IP检测同一裂解条件下共同富集的蛋白，结果受去污剂、盐、抗体、丰度和洗涤影响。Input证明有表达、IgG和珠子对照评价非特异，未结合液帮助判断bait是否被捕获；相互作用仍可能由核酸或其他蛋白间接桥接。

04材料与仪器

• NIH/3T3细胞裂解物、已验证鼠抗β-catenin、同亚型正常鼠IgG及Protein G磁珠。
• 1 M Tris pH7.5、5 M NaCl、10% NP-40、100×蛋白酶抑制剂、水，低吸附管、4°C端对端旋转器、磁力架。
• BCA定量设备、2×还原上样液、WB条件及区分bait/prey的验证抗体。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

至少准备特异IP、同亚型IgG、无抗体珠子空白三管，以及每样本5%Input。三管500 μg合计需1.5 mg蛋白，另加Input和定量损耗；裂解批次应有足够总量。每20 μL原珠悬液的结合容量须由手头批次数据覆盖2 μgIgG，容量不同则先验证。采用平行生物学样本，不把三类对照当三重复。

08逐步操作

1. 冰上向约50 μL细胞沉淀加500 μL温和裂解液，轻吹打散开，冰上30分钟，每10分钟轻混；不加SDS或脱氧胆酸。
2. 4°C16000×g离心15分钟，取澄清上清，不碰沉淀；以兼容BCA测总蛋白，必要合并同一已定义样本的裂解物获得足量输入。
3. 用同裂解液把蛋白统一到1 mg/mL，分三管各500 μL；另留原样25 μL为相对单IP输入的5%Input，立即加入25 μL 2×上样液，分装保存。
4. 特异管加2 μL、1 mg/mL鼠抗β-catenin；IgG管加同浓度同亚型IgG2 μL；珠子管加抗体稀释液2 μL。实际抗体浓度不同按2 μg计算并统一总体积。
5. 三管4°C端对端缓慢旋转12–16小时，保证液体流动而不产生大量泡沫，记录实际时间。
6. 充分重悬Protein G原珠液，每管另取20 μL原悬液，磁吸约1分钟至澄清，弃保存液；用500 μL裂解液重悬、磁吸，重复3次，不让珠子干燥。
7. 将各管抗体-样本混液完整转到对应洗后珠子，4°C端对端旋转2小时。每次转移核对管号，不能交换IgG和特异珠子。
8. 磁吸1分钟，收集上清为未结合组分，取25 μL加25 μL 2×上样液留查bait去除效率；剩余上清按计划留存或处置。
9. 每管珠子加500 μL冰冷裂解液，4°C缓转5分钟，磁吸1分钟弃液，连续洗3次；洗涤强度保持一致，不只把某个对照洗得更干净。
10. 最后彻底吸去可见洗液但不吸珠，加入15 μL 2×还原上样液及15 μL水，成30 μL 1×液，轻混。95°C加热5分钟，磁吸后取上清到新管，避免磁珠进入胶孔。
11. 以相同上样体积分析特异IP、IgG及珠子对照，另上定义好的Input和未结合液；若需要比较捕获率，应按各管总体积换算，不能直接比原始条带深浅。
12. WB先检测bait是否富集，再检测prey α-catenin；选抗体物种和检测方式避免IP抗体重/轻链干扰，在约100 kDa处仍需特异性验证。
13. 只有Input含bait/prey、特异IP有可复现的prey富集且IgG/珠子背景低时才记录共同富集；进一步做反向IP、核酸依赖性或独立方法验证，不能称为直接物理结合。

09结果判断与质控

有效结果包括明确的bait捕获和对照背景，阴性不能证明细胞内没有相互作用，可能是裂解破坏或抗体不可用。本文2 μg抗体、500 μg蛋白和20 μL珠子是已定义的教学起始量，换靶标、珠型或样本须重新验证，不能据一次Co-IP声称普遍互作。

10实验记录模板

11常见问题与排错

bait捕获不到

查IP适用性、表达量、珠子结合容量和抗体物种，不先把prey阴性解释为无互作。

IgG背景高

检查珠量过多、非特异吸附和洗涤条件，做小规模滴定；保留相同处理对照。

只有一次出现prey

复查输入、曝光和重复，增加反向或独立证据，避免选择性报告。

12参考资料

• STAR Protocols：An optimized co-immunoprecipitation protocol，PMC8920916：已读抗体适用性、匹配IgG、输入、洗涤及互作验证原则。本文是明确另行定义的非共价Protein G/WB教学体系，未把原文质谱环氧珠用量移植为厂家通用参数。