01本篇适用条件
仅用于已知内容的ATCC HeLa CCL-2冻存管：本例1 mL、约2×10⁶个冻前活细胞、5%DMSO，来源于本系列冻存方案。培养基为ATCC配方EMEM（30-2003）+10%FBS（30-2020），37°C/5%CO₂。细胞库新到批次的推荐接种容器和稀释比例应先核对批次证书；若该批不是本例1 mL/2×10⁶细胞，不能直接沿用T25和5 mL的教学设置。
CCL-2产品页复苏离心范围是150–400×g、8–12分钟，本例选择200×g、10分钟，避免混入其他细胞的条件。本页不适用于必须直接稀释免离心的脆弱细胞。液氮取管由受训人员完成，新到或来源未经本室确认的细胞按隔离培养准入流程管理。
02实验原理
先准备好培养环境再取管，快速解冻并及时稀释DMSO。用同一批完全培养基完成稀释、重悬和接种；离心去掉大部分保护剂后再恢复培养。第一次活率只说明膜完整性，随后贴壁与增殖记录才说明这管能否建立稳定培养物。
03安全与适用范围
HeLa CCL-2为ATCC BSL-2。液氮管可能破裂或增压，按设施取管、启封与面部防护流程操作；水浴管盖接口不入水。开盖和移液在Ⅱ级生物安全柜内进行，离心使用相容封闭管和适配器。
04材料与仪器
- 已核对编号与冻存配方的HeLa CCL-2一管、T25组织培养处理瓶一支、15mL无菌离心管。
- 完全培养基至少20mL；计数和活率材料、无菌移液管、移液器、计时器。
- 37°C水浴或已验证解冻设备、Ⅱ级生物安全柜、可设置200×g的离心机、倒置镜、37°C/5%CO₂培养箱。
- 取管面部和低温防护用品、设施批准转运容器、70%乙醇及低温管启封保护流程。
05配液与用量
| 用途 | 具体量 | 总量或计算 |
|---|---|---|
| 完全培养基100 mL | EMEM 90 mL + FBS 10 mL | 10%FBS |
| 解冻前15 mL管 | 完全培养基9.0 mL | 等待加入细胞 |
| 1支冻存管 | 悬液1.0 mL | 加入9mL后约10mL，5%DMSO先降至约0.5% |
| T25预加 | 完全培养基4.0 mL | 接种前至少37°C/5%CO₂平衡15分钟 |
| 离心后重悬 | 完全培养基1.0 mL | 取20µL计数后，向T25转入0.98mL |
| 取样补偿 | 完全培养基20µL | T25终体积4.0+0.98+0.02=5.00mL |
| 18–24小时换液 | 新鲜完全培养基5mL | 吸去原液后补入，不是再加到10mL |
实际接种活细胞数=重悬液活浓度×0.98 mL。例：离心重悬后1.5×10⁶活细胞/mL，实际接种1.47×10⁶个活细胞；不要把冻前标称2×10⁶直接记为复苏后真实接种数。
06时间安排
| 时间 | 操作 |
|---|---|
| 取管前25–15分钟 | 预温培养基、T25加入4mL并平衡至少15分钟 |
| 取管后约0–2分钟 | 37°C快速解冻，盖接口保持不入水 |
| 接着约3分钟 | 管外消毒、柜内转入9mL培养基 |
| 接着10分钟 | 室温200×g离心 |
| 接着5分钟 | 重悬、计数、加入T25，终体积5mL |
| 18–24小时 | 拍照并第一次换液 |
| 48、72小时 | 观察增长与形态，安排准入检测 |
07开始前的准备
- 先核对冻存标签、入库位置、细胞身份、代次、冻存日期、配方和预定培养条件，给T25写明复苏日及来源管号。复苏本身不自动增加传代数；下一次实际分瓶时再增代次。
- 在无菌15mL管预加9.0mL完全培养基；另一支T25加4.0mL，在37°C、5%CO₂培养箱平衡至少15分钟，尽量让pH在ATCC给出的7.0–7.6范围内。准备另1mL重悬液和次日换液用培养基。
- 设置离心程序200×g、10分钟、室温（约20–25°C），配好适配器和等质量配平管。确认水浴实测37°C、无菌柜无报警。
- 所有步骤就绪后再由受训人员取管，不能一边让冻存管升温一边找试剂。出现冻存管裂纹或异常压力迹象，按设施异常流程处理，不强行开盖。
左为未污染、右为污染培养物的Hoechst染色，保留两幅原始面板。此为来源指南的污染观察示例，未指明是HeLa；日常明场观察正常不能排除支原体，也不能仅凭此图确诊自己的培养物。
08逐步操作
- 按低温设施要求取出目标冻存管并核对管号，在指定转运保护下带到解冻位置。避免冻存管在手中或室温长时间停留，也不反复进出液氮。
- 依设施启封保护流程处理后，将管下部放入37°C水浴，轻柔转动；O形圈和盖接口始终高于水面。约2分钟内容物刚融化即取出，不留在水浴继续保温。
- 用70%乙醇处理管外表面并按本室消毒接触要求操作，转入生物安全柜。打开管盖前确认外侧不会把水滴带入内容物。
- 用无菌移液器将约1mL细胞悬液缓慢转入预加9.0mL完全培养基的15mL管，轻柔倒转或吸打混匀，不产生气泡。此时总量约10mL，保护剂被先稀释10倍。
- 盖紧离心管并配平，在室温200×g离心10分钟；检查程序显示的是×g而不是rpm。结束后轻拿，不剧烈晃动软沉淀。
- 在柜内缓慢吸去上清，保留可见沉淀，不直接倾倒到开放废液瓶。用1.0mL新鲜完全培养基轻柔重悬，约3–5次吹打至无大团块，不为追求完全无碎片而反复冲击。
- 轻柔混匀后取20µL进入独立样本管，按1:1台盼蓝方案计数，记录活细胞浓度与活率。原培养悬液等待时保持在柜内受保护，不能把染色样本再加回来。
- 将剩余约0.98mL未染色细胞悬液加入已平衡4.0mL培养基的T25，再加入20µL完全培养基补偿计数取样。最终5.00mL，前后左右各轻移2次，放回37°C、5%CO₂。
- 记录完成解冻、稀释、离心和回箱的实际时间，保存即刻形态图。18–24小时观察后，若已见贴壁且状态可接受，缓慢吸去原培养液，沿壁加入预温完全培养基5mL；漂浮碎片较多时不猛烈PBS冲洗。
- 在48、72小时继续记录贴壁形态、汇合度和增长。达到稳定增长后再按传代教程扩增，并完成支原体等准入检测。未恢复、未检测合格的复苏物不直接投入正式药物或迁移实验。
09结果判断与质控
本例可预设复苏即刻活率≥80%、24小时有贴壁、72小时见增长为教学质控目标，但这些不是ATCC对每支管的保证。即刻活率高而24小时大量死亡也应判为恢复异常。记录细胞是否均匀贴壁、死亡碎片是否逐步减少，而不是仅写“已复苏”。
左为活率、右为贴壁率，四组从左至右为3T3、VERO、HEp-2（右图标作HEp-2C）、BSC-1。原图比较无血清冻存液与含FBS冻存液，不含本篇HeLa，也不是本篇90%FBS加10%DMSO配方的验证；两种终点不可互相替代。仅遮去原图细胞名称前的目录货号，数据、细胞名与图例完整保留。
10实验记录模板
| 复苏管号/代次 | 冻前配方/细胞数 | 解冻起止/温度 | 稀释量 | 离心×g/分钟/温度 | 重悬体积 |
|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| T25编号 | 活浓度/活率 | 实际接种数/终体积 | 回箱时间 | 24h换液/图片 | 48–72h增长/检测 | 偏差 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
11常见问题与排错
- 看不到沉淀：不要立即吸到底；核对转子方向、×g与实际细胞数，在光线下找软沉淀。必要时由熟练人员协助，记录上清处理偏差。
- 活率高却不贴壁：查T25是否为组织培养处理表面、培养基是否配错、pH及CO₂是否异常、细胞数是否不足；不要盲目加更多血清。
- 第二天碎片较多：结合贴壁活细胞与后续增长判断，温和换液去除碎片；如果持续恶化，检查冻存与低温运输记录。
- 迟迟不恢复：保留观察记录并查污染、身份和冻存批次，必要时重新启用合格库存；不反复高强度离心“清洗”挽救细胞。
12参考资料
- ATCC：HeLa CCL-2，Handling procedure：已阅读37°C约2分钟、9mL完全培养基、150–400×g 8–12分钟、培养液预平衡至少15分钟及T25/T75接种建议。
- ATCC：Animal Cell Culture Guide，Recovery of cryopreserved cells：恢复观察与低温管理。
- 200×g/10分钟选在该株推荐范围内；5mL/T25、取样补偿、18–24小时首次换液和恢复阈值为本例教学设置，需本室验证。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。