细胞黏附实验：纤连蛋白包被与60分钟洗后保留量

02实验原理

比较纤连蛋白包被和PBS模拟包被两组，均做BSA封闭，每组至少3孔。统一洗涤后留下的细胞反映本操作条件下的黏附/保留，不能单独证明某一整合素机制。结晶紫吸光度主要是附着细胞生物量，若要求真实百分比，必须用计数校准，不能将OD直接当细胞数。

04材料与仪器

Corning356008纤连蛋白、HeLa；96孔板；PBS、EMEM、细胞培养级BSA；4%甲醛、Sigma结晶紫C0775、乙酸；计数板、读板仪570nm或整孔明场成像系统。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先预试30、60分钟和每孔5000、10000细胞，选择未过密、背景较低的窗口。每组设无细胞包被空白，另设不洗的细胞输入参考孔；不洗参考若有漂浮细胞不能直接当“100%黏附”。确认板面积及仪器570nm滤片，整个实验固定洗涤方向、次数、吸液位置和力度。

08逐步操作

1. 按表配10µg/mL纤连蛋白液，给包被孔各加50µL，对照孔加50µL PBS，37°C放1小时，盖好防蒸发。
2. 吸去包被液，PBS100µL沿壁轻洗2次，不能让包被表面长时间风干。
3. 每孔加100µL1%BSA/PBS，37°C封闭30分钟；所有组使用相同封闭条件。
4. 收获同批HeLa为单细胞，温和终止解离，200×g5分钟收集，以黏附液洗一次去FBS，重新计活浓度。
5. 将细胞配成1×10⁵活细胞/mL；去封闭液并轻洗一次，每孔加100µL细胞液，即1×10⁴活细胞。
6. 37°C、5%CO₂孵育60分钟，不在中途震荡板；细胞从圆形向铺展变化可拍照但不能只据形状判断黏附强度。
7. 终点轻柔吸去悬浮液，沿相同孔壁加入100µL温PBS再吸走，共洗3次；不直接向细胞中心喷液。
8. 加100µL商业4%甲醛，室温固定15分钟，PBS洗2次。
9. 加100µL0.1%结晶紫，室温20分钟，用水温和漂洗至无明显浮色，再干燥。
10. 先拍整孔图，记录明显脱落与染料沉淀；需黏附百分比时用整孔图可靠计完整细胞，并除以真实输入活细胞数。
11. 相对生物量法每孔加100µL10%乙酸，室温轻摇10分钟使染料溶出，读取570nm，扣本包被条件无细胞空白。
12. 相对保留量=处理净OD÷参照净OD×100%，明确它不是绝对黏附率；各孔技术重复先汇总，再按独立培养批次分析。提取液有明显未溶染料时先轻混并核对时间，不给个别孔额外补乙酸改变体积。

09结果判断与质控

完整计数8000个黏附细胞、输入10000个时，黏附率80%。若净OD为0.40而参照0.50，相对保留量80%，两个“80%”含义不同，只有建立OD—细胞数线性关系才能相互换算。

10实验记录模板

11常见问题与排错

两组几乎全掉：查消化损伤、无Ca/Mg环境和洗涤力度。对照背景高：查封闭、血清残留及板本身黏附性。OD高但细胞少：查染料沉淀、空白和洗涤，不通过增加提取体积随意改变各孔结果。

12参考资料

• Corning：356008人纤连蛋白官方产品页，已读取来源、冻干形式及1–5µg/cm²包被范围。
• ATCC：HeLa CCL-2。复溶候选、37°C1小时包被、60分钟黏附、染提取参数为教学设置，需本室验证。