Calcein-AM/PI 活死染色：300µL悬液双染与逐细胞计数

02实验原理

活细胞内酯酶将Calcein-AM转为绿色染料，PI进入膜受损细胞并染核呈红色。绿色减少也可能来自酯酶或转运变化；双阴性和双阳性应分别记录，不能强行全分为活或死。相同曝光下逐细胞计数比直接比较整图总绿色更容易解释。

04材料与仪器

CS01全套；HeLa悬液；无钙镁D-PBS；离心管和盖玻片/成像腔室；离心机、计数板；37°C孵育设备；绿色Calcein和红色PI通道的荧光镜。至少准备健康、膜损伤阳性、未染及两个单染控制。

05配液与用量

工作液按厂家“5mL PBS加10+15µL”原配方如实记录，总量并非精确5mL。现配当天使用，先让原液回室温再开盖，防Calcein-AM吸潮。

06时间安排

07开始前的准备

以健康细胞及独立热损伤细胞建立识别边界，热处理条件仅作教学候选，不保证100%死亡。各样本取相同细胞数；先对未染样本检查自发荧光。官方悬液法的离心示例为1000rpm，因转子不同不能照搬，本例选择200×g5分钟，须在本室确认回收率。

08逐步操作

1. 显微记录HeLa状态，完整保留培养上清，合并温和解离后的细胞，不丢弃漂浮死细胞。
2. 室温200×g离心5分钟，缓慢吸去上清，以1mL D-PBS重悬。
3. 重复同条件洗2次，必要时共3次，以减少血清和培养基中酯酶影响；记录次数，避免无限洗涤造成额外损伤。
4. 取独立样本计数，用D-PBS调整总细胞浓度至5×10⁵/mL；这里分母为所有可识别完整细胞，另记起始活率。
5. 分健康、未染、单染与处理组，每管200µL；热损伤控制单独65°C10分钟后冷却，不能热处理研究样本。
6. 现配双染液：5mL D-PBS中加入10µL A和15µL B，混匀避光，标注配制时间。
7. 给双染样本各加入100µL工作液，轻混；单染和未染管按相应缺省配方处理，总反应体积均300µL。
8. 37°C避光孵育15分钟，不固定、不透化；超过此时间另行验证，不能放到第二天再比活率。
9. 轻柔混匀，取适量到相同厚度的成像腔室，先拍明场定位，再拍绿色和红色通道，曝光由对照确定并固定。
10. 每份在预设5个不重叠视野内逐细胞记录绿+/红−、绿−/红+、双阳和双阴，目标合计至少300个完整细胞。
11. 按预先规则定义存活为绿+/红−，活细胞比例=该类个数÷全部完整细胞数×100%，并单列其他三类。
12. 保存原图与计数，若双阴较多或对照不合格，先排查染料、酯酶和成像，不把未知状态自动归死细胞。

09结果判断与质控

300个完整细胞中255个绿+/红−、30个PI阳性、15个双阴，则明确活细胞比例为85%，同时报告PI阳性10%、状态未定5%。如果不设总细胞识别方式而只拍绿色细胞，无法得到可信分母。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全绿弱而PI不升：检查Calcein吸潮、培养基酯酶残留、细胞代谢和曝光，不直接判断全部死亡。背景绿：增加规范洗涤并现配工作液。双阳多：可能膜损伤过渡态或通道串色，核对单染与时程，保留双阳记录。

12参考资料

• Dojindo：CS01官方说明书，已读取1mM Calcein-AM、1.5mM PI、5mL PBS加10/15µL、200µL细胞加100µL染液及37°C15分钟。
• ATCC：HeLa CCL-2。×g离心条件、热损伤控制和计数目标为教学设置，需对回收与染色表现验证。