Bradford 蛋白定量：5 μL 样本的595 nm微孔板法

02实验原理

酸性环境中考马斯G-250与蛋白结合后蓝色吸收增强，在595 nm相对于BSA标准估算总蛋白。不同蛋白显色响应不同，所以结果是BSA当量；Bradford响应并非全范围线性，必须每板做曲线，不能把某一点的吸光度比例直接推广到所有浓度。

04材料与仪器

• 指定即用型Bradford试剂、2 mg/mL BSA储备液（本例在PBS中）、同批PBS。
• 独立来源或独立配制的0.75 mg/mL BSA检查液100 μL，未知蛋白至少30 μL。
• 透明平底96孔板、支持595 nm的酶标仪、板振荡器、P20/P200/P1000、清洁枪头与1.5 mL管。

05配液与用量

18孔需4.50 mL即用试剂，另取至5 mL作移液余量，不稀释该即用试剂。两种未知稀释分别直接由原样配制，避免把1:2再稀释误记成1:4的原始记录。

06时间安排

07开始前的准备

先将取出的5 mL试剂平衡至室温，轻颠倒混匀；不猛烈振荡起泡。核实样本基质、BSA溶剂和空白一致。板图标六个标准双孔12孔，检查液双孔2孔，未知两稀释双孔4孔。独立检查液不取自本次六点曲线管，预设回算为标称值80%–120%、未知双孔CV≤10%作为教学检查线；它们不是通用认证指标。

08逐步操作

1. 标记六支BSA标准管及两支未知稀释管，写下储备浓度2 mg/mL和PBS批次。
2. 按配方表先加PBS再加BSA，每个来源换新枪头；各管吹打8次混匀，不只搅动表层。
3. 未知两支管分别用10 μL原样加入10及30 μL PBS，混匀后标稀释倍数2和4。
4. 在板图对应18孔各加5 μL标准、检查液或未知；枪头靠近孔底排液，确认小液滴确实进入孔内。
5. 将指定即用型试剂轻颠倒数次，分取5 mL到洁净容器，剩余原瓶按标签保存；不把剩余工作份倒回。
6. 按固定顺序向各孔加入250 μL试剂，记录第一孔和最后一孔加液时间；加样节奏一致。
7. 在板振荡器轻摇30秒，使所有孔均匀，避免喷溅到邻孔；检查光路范围无明显气泡。
8. 室温20–25°C放置10分钟；标准、检查液和未知同板同批计时，不只给未知延长显色。

   

9. 设595 nm读取全板，保留原始每孔读数、温度和读板时间，不只保存软件浓度。
10. 求零蛋白双孔平均值，从其他每孔读数扣除；检查标准是否随浓度上升，核对重复孔。
11. 用合适二次或分段曲线在本次标准范围内插值，不强制全范围线性过原点；记录拟合类型和有效范围。

    

12. 回算独立0.75 mg/mL检查液，检查80%–120%教学线；失败时先查配标、试剂、气泡和计时，再重测整批。
13. 未知曲线浓度分别乘2或4还原原浓度，比较两个落在有效范围的结果；差异明显时查基质干扰，不能挑选更符合预期的一种。
14. 报告均值、重复性、稀释倍数及“BSA当量”；收集染料废液并保存标准曲线、板图和异常说明。

09结果判断与质控

空白稳定、曲线单调、独立检查液合格且未知在范围内才可报告。比如1:2稀释液测得0.40 mg/mL，则原样0.80 mg/mL=0.80 μg/μL。某蛋白与BSA响应不同仍可导致系统偏差；不同组样本基质必须一致。去污剂造成的蓝色不能通过扣空白自动修复。

10实验记录模板

11常见问题与排错

标准曲线弯曲

Bradford本来可非线性；先确认点值和重复，不为提高R²任意删除高点。

两种稀释回算不一致

检查稀释计算和缓冲液干扰；增加稀释但保持检测值在有效范围，必要时换兼容方法。

全板噪声大

查气泡、混匀不足、试剂是否变色或污染；确认595 nm设置及板型。

12参考资料

• 用户提供《分子生物学实验方法 老文档 仅供参考》PDF物理第35页及《分子生物学实验手册 来源网络仅供参考》PDF物理第167页：蛋白定量线索，不采用“任意RIPA可直接测”或未定义的旧染液体积。
• Thermo Fisher Scientific，Pierce Bradford Protein Assay Kit User Guide，修订C.0，物理第1–3页，查阅日期2026-11-02：已核对每孔5 μL加250 μL、摇30秒、室温10分钟、595 nm及非线性；本文六点标准、双稀释与检查线为教学设置。